Zhang Nan, Zhang Xiaoli, Zhao Yunfang
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Shandong University, Jinan, 250100, Shandong, China)
Abstract A new method for the quantitation of DNA was developed by the voltammetric study of the ternary system of Lomefloxacin(LMF)-Mg (II)- DNA. In the NH -NHCl buffer (pH=9.10), a well-defined irreversible and adsorptive reduction peak at E= – 1.63V (vs.SCE) was obtained by cyclic voltammetry ( CV) , when adding DNA to LMF-Mg (II) solution and the peak current (I) was proportional to the concentration of DNA. The linear range is 5.00×10-6– 2.20×10-5 g/mL for calf thymus DNA(ctDNA), and 1.67×10-7– 3.67×10-7g/mL for fishDNA(fsDNA). The effective factors and optimum conditions have been studied and the detection limits of ctDNA and fsDNA are 3.30×10-6g/mL and 1.00×10-7g/mL, respectively. The proposed method exhibited good recovery and the relative standard deviation is RSD=3.4%(n = 5).
洛美沙星－镁络合物与DNA作用的伏安行为研究
张楠张晓丽赵云芳
(山东大学，化学与化工学院，济南，250100
2003年月日收稿
摘要通过对三元体系洛美沙星－镁－DNA的伏安行为的研究，建立了配合物洛美沙星－镁LMF-Mg(II))测定核酸的新方法。 在NH -NHCl 缓冲溶液pH=9.10中，LMF-Mg(II与DNA作用产生一个不可逆的并具有吸附性质的还原峰，峰电位为1.63Vvs.SCE，其峰电流与DNA的浓度成正比，ctDNA和fsDNA的线性范围分别为 5.00´ 10-6－2.20´ 10-5g/mL和1.67´ 10-7－3.67´ 10-7g/mL。 检出限分别为3.30´ 10-6g/mL 和1.00´10-7g/mL 。相对标准偏差RSD=3.4n = 5。
关键词 洛美沙星；洛美沙星－镁；核酸；伏安法
脱氧核糖核酸DNA是一类很重要的生命物质，是生物体遗传信息的载体，对DNA的研究是生命科学领域中极其重要的内容。DNA的电化学研究不仅用于核酸的测定而且用于核酸的结构分析，并可以为DNA与金属螯合物、小分子物质等的相互作用提供依据。由于核酸的电化学信号很弱，直接测量效果较差，选择能与核酸作用的电活性指示剂成为热点。目前，米托蒽醌MX[1]、TMAP[2]、CuTMAP[3]、诺加霉素[4]、道诺霉素[5]等物质已被证实与DNA发生嵌入作用生成非电活性物质。本文基于抗生素金属配合物LMF-Mg(II与DNA作用生成新的电活性物质的现象，研究了三元体系LMF-Mg(II-DNA的伏安行为，据此建立了一种测定核酸的新方法。LMF-Mg(II与DNA相互作用的研究还对进一步了解喹诺酮类药物的作用机理和毒性以及新一代药物的设计合成有很大的意义。
1 实验部分
1．1 化学试剂与仪器
洛美沙星LMF，1.00´10-3mol/L)(山东省医药工业研究所，鲱鱼精子DNAfsDNA，1.00´10-4g/mL)(Sigma, USA，小牛胸腺 DNActDNA，1.00´ 10-3g/mL)(Sigma, USA，NH -NHCl缓冲溶液pH=9.10，以上试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 MF-1A型多功能伏安仪(江苏电分析仪器厂，三电极为悬汞电极自制、饱和甘汞电极、铂电极，X-Y函数记录仪上海大华仪表厂，pHS-2型精密酸度计上海雷磁仪器厂。
1．2 实验方法
取一定体积0.08 mol/L的NH-NHCl缓冲溶液pH=9.10于电解池中，通N除氧15分钟后，依次加入洛美沙星标准溶液, MgSO溶液，DNA溶液，预富集60s，静止30s，电极面积为0.0234㎝，富集电位Ea=1.20V，在1.201.80V范围内进行扫描，记录核酸加入前后的伏安曲线。
2 结果与讨论
2．1 循环伏安图
LMF 在 1.53Vvs.SCE处有一个很弱的峰(a，随着MgⅡ的加入，在 -1.55Vvs.SCE处产生一个灵敏的LMF-Mg(II络合物的峰，DNA的加入使此峰降低，同时在- 1.63V处产生一个新的不可逆的还原峰(c)。c峰与DNA的浓度变化成线性关系，所以本文选择c峰作为研究对象。
图1 体系的循环伏安图
0.08mol/L NH-NHClpH = 9.10, t=60s,
=30s ,v=100mV/s, A = 0.0234㎝，
LMF：5.00´ 10-6mol/L LMF
LMF-Mg(II) (：+1.25´ 10-5mol/L Mg(II)
LMF-Mg(II)-ctDNA+ 6.00´ 10-6g/mL[ctDNA].
2．2 最佳反应条件的选择
NH -NHCl缓冲液浓度为0.08 mol/L，pH=9.10,当Mg(II)浓度与LMF浓度比为2.5:1，Ea = -1.20V时，峰(c)最对称，Ip较大。LMF-Mg(II)与DNA 4分钟后反应完全，且1小时内电流Ip保持不变。此外，随着富集时间的增长，Ip呈线性增长，本文及以下实验所选富集时间均为60s。
2．3 共存物质的影响
在最佳实验条件下，固定 ctDNA的浓度为6.70´ 10-6g/mL，对脯氨酸、赖氨酸等多种氨基酸和金属阳离子进行了干扰实验，发现Co2+, Ni2+有较大干扰，但当Co2+, Ni2+浓度一定时，用标准加入法测定样品时不影响测定结果。
3 分析应用
在最佳实验条件下，ctDNA和fsDNA的线性范围分别为5.00´ 10-62.20´ 10-5g/mL和1.67´ 10-73.67´ 10-7g/mL ，检出限分别为3.30´ 10-6g/mL 和1.00´ 10-7g/mL, 线性回归方程分别为 Ip = 4.532+0.867 C(Ip,A; C,10-6g/mL和 Ip= 8.838+0.060 C (Ip,A; C, 10-6 g/mL, 相关系数分别为0.9989和0.9956。用标准加入法测定合成样品样品含MnSO1.00´ 10-6 mol/L , pbNO 1.00´ 10-5 mol/L, ctDNA6.70´ 10-6g/mL，回收率为96 -108 , 相对标准偏差RSD=3.4n = 5。