Chen Huamei, Yue Fan, Wang Jide*, Feng Shun, Liu Aihua ,Yang Hongwei
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830046)

AbstractThe kinetic of bis(L-histidino)zinc(II) catalyzing -nitrophenyl acetate(NA) hydrolysis was investigated at 20°C,pH 8.1-9.4 by kinetic spectrophotometic analysis. The catalytic rate follows the law of dC/dt = ( k_obs C_Zn+ k_OH [OH^-1] + k ) C_NA.The hydroxyl specie Zn(his)(OH) is the active specie as a nucleophile reagent promoting NA hydrolysizing at the range of pH. The rate constant of Zn(his)(OH) hydrolysizing NA is 0.287 mol^-1· L ·s^-1. By the analysis of the crystal structures of Zn(his)·n HO (n = 2 or 5) , in which the-amino of histidine forms a hydrogen bond with a water molecular, we deduced that in the process of NA hydrolysis the hydroxyl of Zn(his)(OH) is bonded on the-amino of histidine by hydrogen bond, not directly bonded on the central metal ion-Zn(II) in basic buffer solution as generally known.

组氨酸锌对p-硝基苯酚醋酸酯的催化水解动力学及机理研究

陈华梅　岳凡　王吉德*　封顺　刘爱华　 杨红伟
(新疆大学化学化工学院, 乌鲁木齐, 830046)

2003年12月31日收稿

摘要在pH=8.1-9.4范围内，于402 nm处，用动力学光度法测定了配合物组氨酸锌催化p-硝基苯酚醋酸酯（NA）的水解速率。催化水解速率对底物（NA）和配合物浓度均呈一级反应，水解反应遵循速率方程dC/dt =(k_obs C_Zn + k_OH [OH] + k) C_NA，催化反应受酸碱平衡控制，在此pH范围内Zn(his)(OH) 是催化型体,其上的亲核基团羟基以氢键结合在配体his的氨基上。
关键词 组氨酸锌；金属水解酶；动力学光度法。

生物体内有很多含金属离子的水解酶，它们能水解蛋白质、磷酸酯、DNA等重要的生命物质，在生物化学反应中起着极其重要的作用。由于天然金属酶结构复杂、稳定性差，对结果的解释也较烦琐，因而模型分子为研究生命过程提供了广泛的可行性。合成具有独特结构的相应酶功能的新的金属酶模型化合物，研究酶相应模型化合物的结构、生物功能和作用机制之间的规律性，将能进一步揭开金属酶的本质^[1]。
含金属的水解酶如碳酸酐酶、羧肽酶、磷酸酯酶等的活性中心结构和催化机理是生物无机化学的热点问题。酶模型研究为我们提供了酶的可能的催化机理。由于锌离子是缺信息(光学、磁学等)离子，现有的研究手段受到很大限制。到目前为止,最成功的模型配合物多为Co^{3+ [ 2,3]}、Cu^2+[4,5]的配合物，但Zn²⁺在水解酶中更常见。如目前研究比较成熟的羧肽酶和碳酸酐酶(CA酶)。羧肽酶的活性中心是Zn²⁺与多肽链的两个组氨酸（69和196）的咪唑基氮原子，以及谷氨酸（72）的羧基氧原子以配位键结合，第四个配位位置与一个水分子松弛地连接，处于畸变的四面体状态。CA酶的活性部位由Zn²⁺ 与三个组氨酸（93、95和117）的3个咪唑基氮原子配位，第四个配位位置可能为水分子或羟基占据，形成畸变的四面体结构^[1]。因此以锌(Ⅱ)配合物作为水解酶模型物的研究更有意义。
基于组氨酸锌在配位环境上更接近生物酶的结构的想法，本文以组氨酸锌作为水解酶的模拟物，以p-硝基苯酚醋酸酯（NA）为底物，研究了其对NA的水解动力学及其机理。用动力学光度法测定了组氨酸锌水解NA的速率，得到了其速率常数；讨论了水解过程的机理，亲核试剂Zn(his)(OH)为活性物种，提出水解过程中羟基不是直接结合在金属离子上的，而是结合在配体his的氨基上的。
                  
羧肽酶分子中Zn²⁺配位环境
The circumstance of zinc(II) in the
mocular of carboxylesterase A

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
MP230型pH计（精度0.001, 配有Inlab 413型电极，Mettler-Toledo上海有限公司）；40270300l型移液器（100-1000l ，1-5 ml ，芬兰Labsystems公司），UV-2450紫外－可见分光光度计（日本Shimadzu公司）。
L-组氨酸（his,光谱纯, 新兴医保）, p-硝基苯酚醋酸酯（NA，Sigma，USA），三羟基甲基氨基甲烷（Tris, 北京奥博星公司）, ZnCl (分析纯)，其余试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
NA水解反应动力学研究在紫外－可见分光光度计上进行，跟踪水解产物p-硝基苯酚阴离子（NP）在402 nm波长下的吸光度，水解反应速率用初始斜率法求得。温度为20℃，以KNO 控制离子强度I = 0.1 mol·L^-1，缓冲溶液0.02 mol·L^-1 Tris–HCl。准确称取ZnCl his = 1 2 , 用pH = 8.5的缓冲溶液配制得配合物溶液。将一定体积的配合物溶液、支持电解质和缓冲溶液的混合液加入到比色皿中，最后用移液器加入一定量的NA的乙腈溶液盖上盖子并迅速摇匀，放入仪器进行测试。反应混和液中含10%（v/v）的乙腈，对溶液pH影响很小。用动力学光度法, 测定水解产物NP在402 nm的吸光度随时间变化率dA/dt，由此得到反应速率= dC/dt = 1/_obs ·dA/dt（_obs为NP的表观摩尔吸光系数），取反应后1分钟内的点，其转化率小于5%，测试至少重复三次。
1.2.1 NP表观摩尔吸光系数_obs的测定
为测定配合物催化NA水解的速率，首先测定水解产物NP ( C_NP = 5.000×10^-5 mol·^-1)在实验条件下的吸光度，波长为402 nm，得到_obs，结果见表1。Zn(his)在在此波长无吸收。

表NP于402nm处的表观摩尔吸光系数_obs
Table 1 The apparent molar coefficient of absorbtion_obs of NP at 402nm
( I = 0.1 mol·L^-1 KNO , 0.02 mol·L^-1 Tris – HCl , 10%（v/v）CHCN )

pH	8.108	8.314	8.532	8.722	9.132	9.394
obs	16880	17620	17920	18360	18640	18640

1.2.2催化反应速率随_NA的变化
恒定_Zn = 2 m mol·^-1,（C_Zn为溶液中锌的总浓度），pH = 8.532, 测定催化反应速率随C_NA的变化。反应速率= dC/d t = 1/_obs·dA/dt，由实验得到的dA/dt及_obs ，可得dC/dt与C_NA的关系，反应对NA呈一级反应，相关系数r = 0.999，结果见图1。
1.2.3催化反应速率随C_Zn的变化
    恒定C_NA = 5 m mol·^-1，在不同pH下，测定催化反应速率随C_Zn的变化，得到dA/dt与C_Zn的关系，结果见图2，反应对C_Zn呈一级反应，相关系数r = 0.942-0.996。

图 C_Zn = 2 m mol·^-1, pH = 8.532, dA/dt(×10^-1 ) 随_NA的变化
Fig.1 C_Zn = 2 m mol·L^-1, pH = 8.532, dA/dt(×10 s^-1vs. C_NA (m mol·L^-1

图 dA/dt (×10 s^-1) 随_Zn (m mol·^-1的变化
Fig.2 dA/dt (×10 s^-1) vs. C_Zn (m mol·L^-1

2 结果与讨论
2.1 k_obs与配合物各种型体随pH的分布曲线
配体质子化常数及配合物稳定常数见表2，并用Repro40和Repro程序^[6]得到配合物各种型体随pH的分布曲线如图3。以下L表示配体组氨酸。

图3 配合物各种型体及_obs（×10）随pH的分布曲线
Fig.3 The curves of species distribution diagram for Zn(II)-L(1:2) and k_obs（×10）vs. pH

表配体质子化常数及配合物稳定常数
Table 2 The protanation constants of ligand and stability constants of Zn-L complexes ( 25.0 ± 0.1℃, 0.1 mol·^-1 KNO )

spices	log[6]
(his) H	9.11
(his) H	15.14
(his) H2+	16.93
Zn(his)	6.48
Zn(his)	11.92
Zn(his)(OH)	1.97
Zn(his)(OH) 2-	-8.84

Zn(his) 在pH 5-8生成，但在溶液中最多不超过30%, Zn(his) 在溶液中pH 7–9.5范围内占50%-90%，为主要成分，说明Zn(his)更容易生成。Zn(his)(OH) 为配合物Zn(his)中键合一个羟基，Zn(his)(OH) ^2-为配合物Zn(his)中键合两个羟基。关于羟基与配合物的键合形式，我们参考了Kretsinger报道的Zn(his)·2H^{[ 7 ]} 和Marjorie报道的Zn(his)·5HO ^[8] 的晶体结构（如图4所示）。在Zn(his)·2HO和Zn(his)·5HO 的晶体结构中都可见到，L – his通过-氨基和咪唑基氮原子与锌配位，羧基为弱配位，水未参与配位，而是与配体形成氢键，锌原子处于四面体中心。- 氨基的两个氢原子，一个与his的羟基氧原子形成N━H┅O分子内氢键，使羟基氧原子靠近中心金属离子形成弱配位键，另一个与水形成N━H┅O(HO) 分子间氢键, 同时水分子的氢原子与两分子的his的羟基氧原子形成氢键O(HO)━H┅O（his）。所以我们可推知在碱性溶液中配体his的- 氨基上氢键键合的水失去质子，形成氢键键合羟基。

图组氨酸锌的晶体结构示意图
Fig.4 The crystal structure of bis(L-histidino)zinc(II)

2.2 配合物催化NA水解k_obs的计算
由图2和图3数据分析，催化反应速率dC/dt与C_NA和C_Zn均呈线性关系，总反应为二级反应。配合物不存在时，NA的水解仍能较快进行，是OH所起的作用。拟定催化反应速率方程如下：
dC/dt = ( k_obs·_Zn + k_OH·[OH] + k·_NA （1）
    k_obs为配合物的表观催化水解速率常数，k_OH为缓冲溶液的催化水解速率常数， k为NA自水解速率常数，k（10 ^-6 mol^-1··^-1 ）很小可以忽略，OH 的影响即为配合物不存在时NA的水解速率dA/dt，即
dA/dt = k_OH·[OH] ·_NA·_obs （2）
    由上式可得k_OH ，其平均值为3.588mol^-1··^-1，将k_OH代入（1）式可得k_obs，计算结果见图3。图中★点为k_obs ，带■的曲线为Zn(his)(OH) 的分布曲线。
由图中可以看出，表观速率常数k_obs与物种Zn(his)(OH) 变化趋势相同，可知催化物种为Zn(his)(OH) ，可得：
_obs·_Zn = k·[Zn(his)(OH)]
_obs = k·= k·
    其中为Zn(his)(OH) 的分布系数，k为催化NA水解的速率常数。对曲线进行拟合计算可得k为0.287 mol^-1··^-1。

2.3催化机理
对金属水解酶的催化机理有三种观点^[9]：（1）Lewis acid机理，金属离子作为路易斯酸和羰基氧原子作用或配位，一定程度上减弱了C = O键的强度（活化了底物），有利于亲核试剂对羰基碳原子的进攻。（2）金属离子活化水分子生成亲核能力较强的M^……OH 形式的亲核试剂。（3）前两种机理的结合，金属离子具有双重活化功能。
本文中Zn(his)(OH)为活性物种，从前面对其结构的分析可知，它并不像机理（2）中所提到的配合物那样，羟基直接键合在金属离子上，而是以氢键的形式键合在- 氨基上的，故此我们认为它的催化机理应如图5所示。在水解反应中Zn(his)(OH) 为亲核试剂，其中的锌与酯的羰基氧结合，稳定并活化底物酯，同时亲核基团羟基结合并进攻羰基的正碳，形成七配位中间体；酯键断开，生成NP和醋酸根离子，配合物迅速结合一个羟基，回到原来状态。文献^{[ 10 ]}中讲到的咪唑水解NA时的亲核试剂是咪唑上键合的水的去质子化形成的羟基形式，这与本文中羟基以氢键的形式键合在- 氨基上是同类水解方式。

图催化反应机理图
Fig.5 The schema of hydrolytic mechanism