Chen Huamei, Yue Fan, Wang Jide*, Feng Shun, Liu Aihua ,Yang Hongwei
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, Urumqi 830046)
AbstractThe kinetic of bis(L-histidino)zinc(II) catalyzing -nitrophenyl acetate(NA) hydrolysis was investigated at 20°C,pH 8.1-9.4 by kinetic spectrophotometic analysis. The catalytic rate follows the law of dC/dt = ( kobs CZn+ kOH [OH-1] + k ) CNA.The hydroxyl specie Zn(his)(OH) is the active specie as a nucleophile reagent promoting NA hydrolysizing at the range of pH. The rate constant of Zn(his)(OH) hydrolysizing NA is 0.287 mol-1· L ·s-1. By the analysis of the crystal structures of Zn(his)·n HO (n = 2 or 5) , in which the-amino of histidine forms a hydrogen bond with a water molecular, we deduced that in the process of NA hydrolysis the hydroxyl of Zn(his)(OH) is bonded on the-amino of histidine by hydrogen bond, not directly bonded on the central metal ion-Zn(II) in basic buffer solution as generally known.
组氨酸锌对p-硝基苯酚醋酸酯的催化水解动力学及机理研究
陈华梅 岳凡 王吉德* 封顺 刘爱华 杨红伟
(新疆大学化学化工学院, 乌鲁木齐, 830046)
2003年12月31日收稿
摘要在pH=8.1-9.4范围内,于402 nm处,用动力学光度法测定了配合物组氨酸锌催化p-硝基苯酚醋酸酯(NA)的水解速率。催化水解速率对底物(NA)和配合物浓度均呈一级反应,水解反应遵循速率方程dC/dt =(kobs CZn + kOH [OH] + k) CNA,催化反应受酸碱平衡控制,在此pH范围内Zn(his)(OH) 是催化型体,其上的亲核基团羟基以氢键结合在配体his的氨基上。
关键词 组氨酸锌;金属水解酶;动力学光度法。
生物体内有很多含金属离子的水解酶,它们能水解蛋白质、磷酸酯、DNA等重要的生命物质,在生物化学反应中起着极其重要的作用。由于天然金属酶结构复杂、稳定性差,对结果的解释也较烦琐,因而模型分子为研究生命过程提供了广泛的可行性。合成具有独特结构的相应酶功能的新的金属酶模型化合物,研究酶相应模型化合物的结构、生物功能和作用机制之间的规律性,将能进一步揭开金属酶的本质[1]。
含金属的水解酶如碳酸酐酶、羧肽酶、磷酸酯酶等的活性中心结构和催化机理是生物无机化学的热点问题。酶模型研究为我们提供了酶的可能的催化机理。由于锌离子是缺信息(光学、磁学等)离子,现有的研究手段受到很大限制。到目前为止,最成功的模型配合物多为Co3+ [ 2,3]、Cu2+[4,5]的配合物,但Zn2+在水解酶中更常见。如目前研究比较成熟的羧肽酶和碳酸酐酶(CA酶)。羧肽酶的活性中心是Zn2+与多肽链的两个组氨酸(69和196)的咪唑基氮原子,以及谷氨酸(72)的羧基氧原子以配位键结合,第四个配位位置与一个水分子松弛地连接,处于畸变的四面体状态。CA酶的活性部位由Zn2+ 与三个组氨酸(93、95和117)的3个咪唑基氮原子配位,第四个配位位置可能为水分子或羟基占据,形成畸变的四面体结构[1]。因此以锌(Ⅱ)配合物作为水解酶模型物的研究更有意义。
基于组氨酸锌在配位环境上更接近生物酶的结构的想法,本文以组氨酸锌作为水解酶的模拟物,以p-硝基苯酚醋酸酯(NA)为底物,研究了其对NA的水解动力学及其机理。用动力学光度法测定了组氨酸锌水解NA的速率,得到了其速率常数;讨论了水解过程的机理,亲核试剂Zn(his)(OH)为活性物种,提出水解过程中羟基不是直接结合在金属离子上的,而是结合在配体his的氨基上的。
羧肽酶分子中Zn2+配位环境
The circumstance of zinc(II) in the
mocular of carboxylesterase A
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
MP230型pH计(精度0.001, 配有Inlab 413型电极,Mettler-Toledo上海有限公司);40270300l型移液器(100-1000l ,1-5 ml ,芬兰Labsystems公司),UV-2450紫外-可见分光光度计(日本Shimadzu公司)。
L-组氨酸(his,光谱纯, 新兴医保), p-硝基苯酚醋酸酯(NA,Sigma,USA),三羟基甲基氨基甲烷(Tris, 北京奥博星公司), ZnCl (分析纯),其余试剂均为分析纯。
1.2 实验方法
NA水解反应动力学研究在紫外-可见分光光度计上进行,跟踪水解产物p-硝基苯酚阴离子(NP)在402 nm波长下的吸光度,水解反应速率用初始斜率法求得。温度为20℃,以KNO 控制离子强度I = 0.1 mol·L-1,缓冲溶液0.02 mol·L-1 Tris–HCl。准确称取ZnCl his = 1 2 , 用pH = 8.5的缓冲溶液配制得配合物溶液。将一定体积的配合物溶液、支持电解质和缓冲溶液的混合液加入到比色皿中,最后用移液器加入一定量的NA的乙腈溶液盖上盖子并迅速摇匀,放入仪器进行测试。反应混和液中含10%(v/v)的乙腈,对溶液pH影响很小。用动力学光度法, 测定水解产物NP在402 nm的吸光度随时间变化率dA/dt,由此得到反应速率= dC/dt = 1/obs ·dA/dt(obs为NP的表观摩尔吸光系数),取反应后1分钟内的点,其转化率小于5%,测试至少重复三次。
1.2.1 NP表观摩尔吸光系数obs的测定
为测定配合物催化NA水解的速率,首先测定水解产物NP ( CNP = 5.000×10-5 mol·-1)在实验条件下的吸光度,波长为402 nm,得到obs,结果见表1。Zn(his)在在此波长无吸收。
表NP于402nm处的表观摩尔吸光系数obs
Table 1 The apparent molar coefficient of absorbtionobs of NP at 402nm
( I = 0.1 mol·L-1 KNO , 0.02 mol·L-1 Tris – HCl , 10%(v/v)CHCN )
pH | 8.108 | 8.314 | 8.532 | 8.722 | 9.132 | 9.394 |
obs | 16880 | 17620 | 17920 | 18360 | 18640 | 18640 |
1.2.2催化反应速率随NA的变化
恒定Zn = 2 m mol·-1,(CZn为溶液中锌的总浓度),pH = 8.532, 测定催化反应速率随CNA的变化。反应速率= dC/d t = 1/obs·dA/dt,由实验得到的dA/dt及obs ,可得dC/dt与CNA的关系,反应对NA呈一级反应,相关系数r = 0.999,结果见图1。
1.2.3催化反应速率随CZn的变化
恒定CNA = 5 m mol·-1,在不同pH下,测定催化反应速率随CZn的变化,得到dA/dt与CZn的关系,结果见图2,反应对CZn呈一级反应,相关系数r = 0.942-0.996。
图 CZn = 2 m mol·-1, pH = 8.532, dA/dt(×10-1 ) 随NA的变化
Fig.1 CZn = 2 m mol·L-1, pH = 8.532, dA/dt(×10 s-1vs. CNA (m mol·L-1
图 dA/dt (×10 s-1) 随Zn (m mol·-1的变化
Fig.2 dA/dt (×10 s-1) vs. CZn (m mol·L-1
2 结果与讨论
2.1 kobs与配合物各种型体随pH的分布曲线
配体质子化常数及配合物稳定常数见表2,并用Repro40和Repro程序[6]得到配合物各种型体随pH的分布曲线如图3。以下L表示配体组氨酸。
图3 配合物各种型体及obs(×10)随pH的分布曲线
Fig.3 The curves of species distribution diagram for Zn(II)-L(1:2) and kobs(×10)vs. pH
表配体质子化常数及配合物稳定常数
Table 2 The protanation constants of ligand and stability constants of Zn-L complexes ( 25.0 ± 0.1℃, 0.1 mol·-1 KNO )
spices | log[6] |
(his) H | 9.11 |
(his) H | 15.14 |
(his) H2+ | 16.93 |
Zn(his) | 6.48 |
Zn(his) | 11.92 |
Zn(his)(OH) | 1.97 |
Zn(his)(OH) 2- | -8.84 |
Zn(his) 在pH 5-8生成,但在溶液中最多不超过30%, Zn(his) 在溶液中pH 7–9.5范围内占50%-90%,为主要成分,说明Zn(his)更容易生成。Zn(his)(OH) 为配合物Zn(his)中键合一个羟基,Zn(his)(OH) 2-为配合物Zn(his)中键合两个羟基。关于羟基与配合物的键合形式,我们参考了Kretsinger报道的Zn(his)·2H[ 7 ] 和Marjorie报道的Zn(his)·5HO [8] 的晶体结构(如图4所示)。在Zn(his)·2HO和Zn(his)·5HO 的晶体结构中都可见到,L – his通过-氨基和咪唑基氮原子与锌配位,羧基为弱配位,水未参与配位,而是与配体形成氢键,锌原子处于四面体中心。- 氨基的两个氢原子,一个与his的羟基氧原子形成N━H┅O分子内氢键,使羟基氧原子靠近中心金属离子形成弱配位键,另一个与水形成N━H┅O(HO) 分子间氢键, 同时水分子的氢原子与两分子的his的羟基氧原子形成氢键O(HO)━H┅O(his)。所以我们可推知在碱性溶液中配体his的- 氨基上氢键键合的水失去质子,形成氢键键合羟基。
图组氨酸锌的晶体结构示意图
Fig.4 The crystal structure of bis(L-histidino)zinc(II)
2.2 配合物催化NA水解kobs的计算
由图2和图3数据分析,催化反应速率dC/dt与CNA和CZn均呈线性关系,总反应为二级反应。配合物不存在时,NA的水解仍能较快进行,是OH所起的作用。拟定催化反应速率方程如下:
dC/dt = ( kobs·Zn + kOH·[OH] + k·NA (1)
kobs为配合物的表观催化水解速率常数,kOH为缓冲溶液的催化水解速率常数, k为NA自水解速率常数,k(10 -6 mol-1··-1 )很小可以忽略,OH 的影响即为配合物不存在时NA的水解速率dA/dt,即
dA/dt = kOH·[OH] ·NA·obs (2)
由上式可得kOH ,其平均值为3.588mol-1··-1,将kOH代入(1)式可得kobs,计算结果见图3。图中★点为kobs ,带■的曲线为Zn(his)(OH) 的分布曲线。
由图中可以看出,表观速率常数kobs与物种Zn(his)(OH) 变化趋势相同,可知催化物种为Zn(his)(OH) ,可得:
obs·Zn = k·[Zn(his)(OH)]
obs = k·= k·
其中为Zn(his)(OH) 的分布系数,k为催化NA水解的速率常数。对曲线进行拟合计算可得k为0.287 mol-1··-1。
2.3催化机理
对金属水解酶的催化机理有三种观点[9]:(1)Lewis acid机理,金属离子作为路易斯酸和羰基氧原子作用或配位,一定程度上减弱了C = O键的强度(活化了底物),有利于亲核试剂对羰基碳原子的进攻。(2)金属离子活化水分子生成亲核能力较强的M……OH 形式的亲核试剂。(3)前两种机理的结合,金属离子具有双重活化功能。
本文中Zn(his)(OH)为活性物种,从前面对其结构的分析可知,它并不像机理(2)中所提到的配合物那样,羟基直接键合在金属离子上,而是以氢键的形式键合在- 氨基上的,故此我们认为它的催化机理应如图5所示。在水解反应中Zn(his)(OH) 为亲核试剂,其中的锌与酯的羰基氧结合,稳定并活化底物酯,同时亲核基团羟基结合并进攻羰基的正碳,形成七配位中间体;酯键断开,生成NP和醋酸根离子,配合物迅速结合一个羟基,回到原来状态。文献[ 10 ]中讲到的咪唑水解NA时的亲核试剂是咪唑上键合的水的去质子化形成的羟基形式,这与本文中羟基以氢键的形式键合在- 氨基上是同类水解方式。
图催化反应机理图
Fig.5 The schema of hydrolytic mechanism