Liu Pengyan，Wang Hongyu，Jiang Ning，Tan Zhiqiang
(College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding, 071002)
Abstract A method was developed for simultaneous separation and determination of seven fluoroquinolones (Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Levofloxacin, Enoxacin, Norfloxacin, Fleroxacin and Lomfloxacin) in pork. The sample was extracted using acid-treated acetonitrile and purified by a C18 solid-phase extraction (SPE), and then was determined by HPLC. The chromatographic system was equipped with a Shimadzu VP-ODS（250 mm×4.6 mm, 5 μm）column and a PAD detector. A mobile phase of methanol-0.02 mol/L phosphate buffer solution-triethylamine (pH 2.8) was used. Determination wavelength was at 281 nm. The limits of detection (LOD) were from 9 to 14 mg/kg. Linearity of calibration curves in concentration range 0.05 to 5 mg/mL were all right (R＞0.999 9). The average recovery was 80-92% except Enoxacin 66-71% and RSD (n=3)＜5%. This study provided a feasible, accurate and sensitive method for the determination of fluoroquinolones.
HPLC-PAD法同时测定猪肉中7种氟喹诺酮类兽药的残留
刘芃岩 王洪宇 姜宁 谭志强
(河北大学化学与环境科学学院，河北保定 071002)
2006年1月9日收稿；河北省自然科学基金项目（B2005000105）
摘要 建立了一种二极管阵列－高效液相色谱同时分离测定猪肉中7种氟喹诺酮类兽药残留的方法（恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、氟罗沙星及洛美沙星)。样品采用乙腈/醋酸提取，经C18 固相萃取小柱净化后，进HPLC系统检测。色谱柱为Shimadzu VP-ODS（250 mm×4.6 mm, 5 mm）；流动相为甲醇-0.02 mol/L磷酸盐缓冲液-三乙胺系(pH 2.8)；检测波长281 nm。检出限达到9～14 mg/kg；标准曲线在0.05～5mg/mL范围内线性关系良好(R＞0.999 9)；加标回收率除依诺沙星在66%～71%外，其它6种均在80%～92%，RSD＜5% (n=3)。该方法准确、灵敏、可操作性强。
关键词 高效液相色谱法；二极管阵列检测器；氟喹诺酮；固相萃取；猪肉
1 引言
氟喹诺酮(fluoroquinolones, FQs)类药物，具有抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强和价格低廉的特点，故在医学和兽医学中应用广泛。但其残留可导致人体内病原体的耐药性[1，2]，而且氟喹诺酮类药物对儿童中枢神经系统的副作用也有报道[3]，所以欧盟（EU）和FAO/WHO食品添加剂与污染物联合专家委员会(JECFA)早在1990年就规定了几种喹诺酮的最大残留量[4]。目前关于氟喹诺酮类残留分析方法的报道较多，通常采用液相色谱法结合荧光检测器[5-11]、紫外检测器[12-14]、质谱检测器[15-17]分离测定或采用毛细管电泳[18,19]。而采用高效液相色谱－二极管阵列检测器法分离检测多种FQs的文献较少[20]，在此文献中报道了动物组织中诺氟沙星、麻保沙星、恩诺沙星、环丙沙星和双氟沙星等5种FQs的分离检测，回收率除了诺氟沙星在98%以上外，其它几种的回收率较低（70%-82%）；本文采用猪肉作样品，经过适当的前处理，7种FQs用高效液相色谱-二极管阵列检测法（HPLC-PAD）得到了很好的分离，且方法的检出限和回收率均达到了残留分析的要求。本文采用HPLC-PAD对FQs分析，实现了紫外吸收在线图谱扫描，极大的方便了检测物质的定性和检测波长的选择，二极管阵列检测器能从保留时间和紫外光谱两方面对FQs进行定性，使结果更准确。
2 实验部分
2.1 主要仪器与试剂
2.1.1. 仪器 日本岛津LC-10Avp高效液相色谱仪，配SPD-M10Avp检测器和SIL-HTA自动进样器；FSH-2型匀浆机（江苏仪通电子有限公司）；C18 SPE小柱（500 mg/3 mL，Spe-edTM，Applied separations Inc.）；LD－4型离心机(江苏亿通电子有限公司)，SK-1型快速混匀器(常州国华电器有限公司)。
2.1.2. 试剂 氟罗沙星(Fleroxacin, FLX)，诺氟沙星(Norfloxacin, NOR)，环丙沙星（Ciprofloxacin, CIP），依诺沙星（Enoxacin, ENO），左氧氟沙星(Levofloxacin, LVFX)，洛美沙星(Lomfloxacin, LOM)（中国药品生物制品检定所），恩诺沙星（Enrofloxacin, ENR）（德国Dr. Ehrenstorfer公司），甲醇、乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。
2.2 色谱条件
色谱柱：Shimadzu VP-ODS（250 mm×4.6 mm, 5 mm）；流动相：甲醇－0.02 mol/L磷酸盐缓冲液/三乙胺系（25：75），流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；进样量10 mL。此条件下，7种FQs能得到有效的分离，如图1(a)所示。
图1 7种氟喹诺酮类药物的色谱图
Fig.1 Chromatogram of seven fluoroquinolones
2.3 标准溶液的配制
2.3.1 储备液 准确称取7种FQs标准品各4.00 mg，分别于7个10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，作为单标储备液，-18℃保存。
2.3.2 工作液 准确移取各单标储备液适量于25 mL容量瓶中，配制成浓度为10 mg/mL的标准混合工作溶液；4℃下保存，保存期1个月。
2.4 样品处理
2.4.1 空白样品 将未检测到氟喹诺酮类药物的新鲜的肉样切碎，每份5.0 g分装在离心管中，在< -18℃条件下冷冻备用，制成空白样品。
2.4.2 加标样品 空白样品在常温下解冻后，向其中加入一定量的标准混合溶液，暗处静置2～3小时。
2.4.3 样品提取 在空白和加标样品中，均加入一定量的标准混合溶液和8.0 mL 1％的醋酸/乙腈提取液，匀浆后以4 000 rpm离心10 min，转移出上清液，样品中再加入8.0 mL提取液重复以上操作，残渣及匀浆杯、刀用4.0 mL提取液洗涤后离心，合并3次上清液，再离心1次，取上清液10.0 mL用正己烷萃取3次（3、2、2 mL），涡旋混匀，弃去上层，下层溶液在50±2℃下，氮吹浓缩至1 mL，待SPE净化。
2.4.4 净化及富集 固相萃取小柱先后用5.0 mL甲醇和5.0 mL水条件化，上样后加入5.0 mL水淋洗柱体，再用4％氨水甲醇溶液6.0 mL洗脱FQs，收集洗脱液于10 mL玻璃离心管中，50±2℃下氮吹浓缩至约0.3 mL，用流动相定容至1.0mL。
2.4.5 样品测定 将定容样品过0.45 mm的滤膜后，进行HPLC分析，添加标样色谱图见图1(b)。
图1 样品色谱图：(a) 氟喹诺酮类标准样品；(b) 添加0.5 mg/kg标样的样品
Fig.1 Chromatograms of sample: (a) Chromatogram of fluoroquinolones; (b) Chromatogram of spiked sample with 0.5 mg/kg of each fluoroquinolone
图2 7种氟喹诺酮类药物的紫外光谱扫描图
Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of seven fluoroquinolones
3 结果与讨论
3.1 检测波长的选择
取1.0 mg/mL的各单标溶液进液相色谱分析，由二极管阵列检测器可得到各标准样品的紫外吸收光谱图（见图2）。综合考虑各物质的最大吸收波长及吸收强度，我们选定281nm处为检测波长。通过比较样品中各色谱峰的紫外吸收光谱图和保留时间，就可以准确判定其是否含有沙星及其种类。
3.2 流动相的选择
分别用甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水两种流动相对7种FQs进行分离发现，各色谱峰形和分离程度没有明显的差别，且乙腈价格高、毒性大，因此选定甲醇系作为流动相。
流速为1.0 mL/min，当甲醇体积分数大于30％时，7种FQs不能完全分离；而小于20％时，保留时间较长且峰形不好；当选用25％时，峰形较好，分离完全且保留时间较理想。
以甲醇和磷酸－磷酸二氢钠－三乙胺缓冲溶液为流动相，通过改变磷酸、磷酸二氢钠及三乙胺的用量调节水系的pH 值，发现磷酸二氢钠浓度在10～20 mmol范围，色谱峰形均较好，因此，选用磷酸二氢钠浓度为10 mmol；固定磷酸的浓度（10 mmol/L），调节三乙胺的用量，考察pH值为2.2、2.6、2.8、3.0发现，pH为2.6、2.8时，7种标样基本分离，而pH为2.8时由于加大了三乙胺的用量，拖尾现象明显改善。所以，选用流动相为：甲醇：10 mmol/L磷酸-10 mmol/L磷酸二氢钠/三乙胺溶液(pH 2.8) ＝ 25：75，流速为1.0 mL/min，此条件下7种FQs能得到很好的分离。文献报道多用乙腈体系作流动相，毒性大，成本高。
3.3 提取溶剂的选择
FQs为两性物质，在稀酸稀碱中溶解性较好[21]。分别用乙腈、乙腈/氨水、乙腈/醋酸作为提取剂发现，乙腈作为提取剂杂质较小，但回收率最低（＜60％）；乙腈/醋酸回收率最高，因此选定乙腈/醋酸为提取剂。通过改变醋酸的浓度发现，杂质的量随着酸含量的提高而增加，因此选定1%的醋酸/乙腈作为提取剂。
3.4 线性范围及仪器检出限
将混合储备液逐级稀释成标准混合溶液系列：5.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.1 mg/mL和0.05 mg/mL，在上述色谱条件下分别进行分析，由回归分析得到这几种组分的校正曲线方程(见表1)，由表可见这几种物质的峰面积与浓度有良好的线性关系，以0.05 mg/mL测定数据计算3倍信噪比求得仪器检出限为5～10 mg/L。
表1 7种氟喹诺酮类药物校正曲线的回归分析及检出限
Tab.1 Regression analysis of calibration curves and detection limit of seven fluoroquinolones
| Compound | Regression equation | Correlation coefficient(r) | Linear range (mg/L) |
Detection limit (mg/L) |
| FLX | Y = (1.40154e-005)X – 0.0405037 | 0.999 9 | 0.05～5 | 7 |
| LVFX | Y = (2.47858e-005)X – 0.0274752 | 0.999 9 | 0.05～5 | 10 |
| ENO | Y = (2.15595e-005)X + 0.0171613 | 0.999 9 | 0.05～5 | 5 |
| NOR | Y = (1.98659e-005)X – 0.0480307 | 0.999 9 | 0.05～5 | 8 |
| CIP | Y = (1.34947e-005)X + 0.0433215 | 0.999 9 | 0.05～5 | 7 |
| ENR | Y = (1.40129e-005)X + 0.0637145 | 0.999 9 | 0.05～5 | 7 |
| LOM | Y = (1.63983e-005)X + 0.0087081 | 0.999 9 | 0.05～5 | 8 |
3.6 回收率、重现性及方法检出限
取空白肉样，向其中准确加入一定量标准混合溶液，按照2.4步骤进行加标回收率实验；加标为0.5 mg/kg和0.2 mg/kg 两个水平，每水平做三个平行样品。回收率、变异系数（RSD％）和定性检出限（LOD）、定量检测限（LOQ）的测定结果见表2。
表2 7种氟喹诺酮类药物在两个水平的加标回收率、重现性及检出限（n＝3）
Tab.2 Average recovery, repeatability, LOD and LOQ of seven fluoroquinolones at two levels of spiking (n＝3)
| Analyte | Level (mg/kg) |
Recovery(%) | Mean (%) |
RSD (%) |
LOD （mg/kg） |
LOQ （mg/kg） |
||
| 1 | 2 | 3 | ||||||
| FLX | 0.5 | 83.1 | 84.0 | 87.0 | 84.7 | 2.4 | 11.0 | 36.7 |
| 0.2 | 88.6 | 91.9 | 92.8 | 91.1 | 2.4 | |||
| LVFX | 0.5 | 82.6 | 82.7 | 87.6 | 84.3 | 3.3 | 11.7 | 39.0 |
| 0.2 | 70.6 | 74.3 | 75.6 | 73.5 | 3.6 | |||
| ENO | 0.5 | 68.5 | 71.4 | 73.7 | 71.2 | 3.6 | 9.1 | 30.0 |
| 0.2 | 63.4 | 64.9 | 69.4 | 65.9 | 4.8 | |||
| NOR | 0.5 | 79.9 | 81.6 | 82.4 | 81.3 | 1.6 | 11.1 | 37 |
| 0.2 | 77.1 | 78.3 | 83.1 | 79.5 | 4.0 | |||
| CIP | 0.5 | 82.4 | 84.1 | 87.9 | 84.8 | 3.3 | 9.5 | 31.7 |
| 0.2 | 88.2 | 92.3 | 96.4 | 92.3 | 4.4 | |||
| ENR | 0.5 | 88.1 | 89.6 | 90.8 | 89.5 | 1.5 | 12.7 | 42.3 |
| 0.2 | 78.3 | 83.9 | 85.6 | 82.6 | 4.6 | |||
| LOM | 0.5 | 82.2 | 85.6 | 85.7 | 84.5 | 2.4 | 13.5 | 45 |
| 0.2 | 90.1 | 94.3 | 96.1 | 93.5 | 3.3 | |||
由表2可见，各分析物的加标回收率除依诺沙星（66%～71%）外，其他均在80%～92%之间，变异系数RSD＜5%，方法检出限在9～14 mg/kg，接近于荧光检测器的检测水平。
3.7 结论
在选定的条件下，通过对猪肉中7种FQs的回收率、重现性和检出限的分析测定，证明本方法能够有效地同时提取、分离和测定7种FQs的残留量，方法的回收率较高，检出限低，重现性良好，可操作性强，可为相关部门制定FQs类兽药残留的检测方法提供良好的参考。依诺沙星回收率偏低，是本文尚待解决的问题。