Wang Sen ^1,2, Zhang Yanhong ^1,2, Zhang Chengming , Dong Xuecheng , Yang Guangyu ^1,2
Department of Chemistry, Yunnan Institute of the Nationalities; Kunming 650031; Yunnan Academy of Tobacco Sciences, Kunming 650106, China)

AbstractA new method for the determination of the olennolic acid and ursolic acid in fructus chaenomelis by high performance liquid chromatography equipped with evaporative light scattering detection (ELSD) was studied. The samples and silica gel (1:4) were homogenized in a mortar for 5.0 min and then packed into a cartridge. The olennolic acid and ursolic acid on cartridge was eluted with 5.0 mL of dichloromethane-acetone (90:10). The dichloromethane and acetone was volatilized and the residue was dissolved with methanol. The olennolic acid and ursolic acid were separated on a ZORBAX Stable Bound C₁₈ (4.6×150 mm, 3.5 m m) rapid analysis column with methanol and water (88:12) as mobile phase, and detected with evaporative light-scattering detector. The olennolic acid and ursolic acid can be separated to baseline within 10 min. The standard recoveries were in the range of 96-103%. The relative standard deviations were in the range of 1.6 – 2.3%. The method was applied to determination of olennolic acid and ursolic acid in fructus chaenomelis samples with good results.
Keywords high performance liquid chromatography; evaporative light scattering detection; fructus chaenomelis; olennolic acid and ursolic acid

基质固相分散高效液相色谱法测定木瓜中的熊果酸和齐墩果酸

王 森^1,2，张艳宏^1,2，张承明，董学畅，杨光宇^1,2
云南烟草科学研究院 昆明650106；云南民族大学化学与生物技术学院昆明 650031)

2007年3月29日收稿

摘要  研究了用基质固相分散高效液相色谱法测定木瓜中熊果酸和齐墩果酸的方法。将木瓜样品与硅胶(W/W, 1:4)充分研磨后装柱，然后用二氯甲烷丙酮(95:5)洗脱样品中的熊果酸和齐墩果酸，介质换为甲醇后，以ZORBAX Stable Bound (4.6 ´ 150 mm, 3.5m) C₁₈色谱柱为固定相，甲醇水(88:12)为流动相分离熊果酸和齐墩果酸，蒸发光散射检测器检测；方法标准回收率为96 103%，RSD为1.6 2.3%。用该方法测定了木瓜中熊果酸和齐墩果酸，结果满意。
关键词  高效液相色谱法，蒸发光散射检测器，木瓜，熊果酸和齐墩果酸

1 引言
中药木瓜(Fructus chaenomelis)是临床常用中药，为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciasa (Sweet) Nakai 的干燥近成熟果实。具有平肝舒筋，和胃化湿的功能。其所含齐墩果酸(olennolic acid)具有降糖作用，熊果酸(ursolic acid)具有较好的抗肿瘤活性^[1,2]。齐墩果酸和熊果酸两者均为五环三萜类成分，目前多采用光度法、薄层扫描法和高效液相色谱法等方法测定^[3-5]。
基质固相分散是一种新样品处理技术，其基本操作是将样品固态或液态直接与固相萃取材料一起混合研磨，使样品均匀分散于固定相颗粒的表面，形成一个独特的色谱固定相装柱，然后依靠所选定的溶剂洗脱样品，它浓缩了传统样品均化，组织细胞裂解，提取，过滤，净化等过程，使样品的预处理变得简便，同时也避免了目标物的损失。由于该方法的简便、样品和溶剂用量少等优点，已被广泛应用于蔬菜、水果和植物中农药、杀虫剂等残留的分析 ^[6-8]。但用于木瓜有效成分分析还未见报道过，我们研究了用基质固相分散处理，高效液相色谱蒸发光散射检测测定木瓜中的齐墩果酸和熊果酸，取得满意结果。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Waters 2695 Alliance高效液相色谱系统，包括四元梯度泵，Empower色谱工作站，ELSD 2000 蒸发光散射检测器 美国Waters公司；Milli-Q50高纯水处理器（美国Millipore公司）；熊果酸和齐墩果酸对照品 中国药品生物制品检定所提供，纯度³98，丙酮、二氯甲烷、甲醇、均为色谱纯试剂（Fisher公司）。实验用水为高纯水。400目球形硅胶 德国墨克公司；用甲醇配制质量浓度均为1.0 g/L的熊果酸和齐墩果酸标准储备溶液，使用前用甲醇稀释成所需浓度的标准工作溶液。
2.2 色谱条件
色谱柱：ZORBAX Stable Bound (4.6´ 150 mm，3.5 m)；流动相为甲醇水 (88:12)，流速为1.2 mL/min；柱温为25 ℃；ELSD的漂移管温度85℃，氮气作载气，流速2.00 L/min，进样量20。在该条件下熊果酸和齐墩果酸标样及木瓜样品的色谱图见图所示。

图1 标样(b)和木瓜子样品(a)色谱图
1.齐墩果酸 2. 熊果酸
Fig. 1 The chromatogram standard sample (b)and fructus chaenomelis samples (a)
1. olennolic acid; 2. ursolic acid

2.3 样品处理
木瓜样品粉碎，过100目筛，称取0.1 g 样品，0.4 g 400目硅胶置于玻璃研钵中，用玻璃杵研磨5 min，使样品与填料均匀混合；装入8 mm ´ 20 mm 的固相萃取小柱中^[9] (在装填管的一端装上筛板，先填入0.2 g 硅胶，然后装入样品并压实，在另一端装上筛板，拧紧柱冒就装好。然后再用5.0 mL二氯甲烷丙酮 (90:10) 洗脱熊果酸和齐墩果酸。洗脱液用氮气吹干，然后用2.5 mL 甲醇溶液溶解，准确调整体积为 5.0 mL，经0.45 针头过滤器过滤，进样5.0 测定。

3 结果与讨论
3.1检测器的选择及ELSD参数
蒸发光散射检测器是通过柱洗脱液进行喷雾，流动相溶剂蒸发，留下的不挥发成分用光照射，检测它的散射光的检测器。可分析任何挥发性低于流动相的化合物。本实验中熊果酸和齐墩果酸没有明显紫外吸收，也没有明显的荧光，因此选择用蒸发光散射检测器检测。
漂移管温度和载气流速是ELSD检测器的两个重要参数。漂移管温度影响检测器的响应，温度升高，流动相蒸发趋于完全，信噪比上升，但温度过高，可能导致组分部分汽化，信号响应值变小。雾化载气流速影响雾化器中液滴的形成，从而影响检测器的响应。信噪比随流速的增加而升高。本文选择漂移管温度为85 ℃，氮气作载气，流速2.00 L/min，可达到最小的噪声信号，色谱图基线平稳。
3.2 样品预处理
基质固相分散是一种新样品处理技术，其基本操作是将样品固态或液态直接与固相萃取材料一起混合研磨，使样品均匀分散于固定相颗粒的表面，形成一个独特的色谱固定相装柱，然后依靠所选定的溶剂洗脱样品，它浓缩了传统样品均化，组织细胞裂解，提取，过滤，净化等过程，使样品的预处理变得简便，同时也避免了目标物的损失。由于该方法的简便、样品和溶剂用量少等优点，本方法中采用基质固相分散法对样品进行前处理。
在基质固相分散中，固相分散剂同时起着支持剂、吸附剂和净化剂的作用，它的选择非常重要。硅胶属于正相材料，对大极性物质有较强的吸附，而小性物质吸附弱，研磨时样品中的各种组分根据极性的不同吸附在硅胶上。根据相似相容原理，在提取木瓜中的熊果酸和齐墩果酸时，木瓜中还含有其它成分，如色素，多酚、蛋白质、有机酸等物质等干扰成分。当木瓜样品和硅胶研磨后，色素，多酚、蛋白质、有机酸等干扰组分吸附在硅胶，用二氯甲烷丙酮(90:10)洗脱时，熊果酸和齐墩果酸被洗下，而与硅胶结合强的极性比熊果酸和齐墩果酸大的成分大部分不被洗下、因此硅胶能好的起到提取净化效果，本实验选择它为分散剂。
为了能让熊果酸和齐墩果酸充分洗下而干扰物尽可能多的被分离，达到制备样品并有效分离干扰物的目的，实验选择用二氯甲烷丙酮(90:10)洗脱熊果酸和齐敦果酸，而与硅胶结合强的极性比熊果酸和齐墩果酸大的多酚、蛋白质、有机酸等成分大部分不被洗下，这样大部分干扰成分被分离。实验表明以 5 mL/min的流速，用5.0 mL洗脱剂可把样品中的熊果酸和齐墩果酸完全洗脱下。
3.3 线性范围与检出限
   将浓度为10g/mL、20g/mL、25g/mL、50g/mL、100g/mL、200g/mL的各系列标准熊果酸和齐墩果酸溶液，在测定条件下进样。根据ELSD测得的峰面积（单位：mV. S）对应熊果酸和齐墩果酸的浓度（单位：g/mL）进行线性回归，得到曲线方程。再将最小质量浓度的标准溶液逐级稀释，依次 样20，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的质量浓度以确定检出限。结果表明：熊果酸含量在10-200g/mL内与峰面积成良好的线性关系，回归方程为：A = 4.28×10 C + 422， = 0.9998；最低检测限为40 ng/mL；齐墩果酸含量在14 – 160g/mL内与峰面积成良好的线性关系，回归方程为：A = 2.95×10 C + 272， = 0.9994；最低检测限为60 ng/mL。
3.4 样品分析结果
木瓜样品每样平行测定次，每次测定取相同的两份其中一份加入0.1 mg熊果酸和齐墩果酸标样，另一份不加，按本文2.3样品处理方法处理后按选定色谱条件测定，按加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算回收率，按次平行测定的结果计算相对标准偏差，结果见表。

表样品分析及结果
Table 1 The determination Results of the Samples

样品	含量(mg/g)	RSD％ (n=7)	回收率％
熊果酸	齐墩果酸	熊果酸	齐墩果酸	熊果酸	齐墩果酸
木瓜大理	0.276	0.318	1.9	2.1	97	103
木瓜丽江	0.223	0.295	2.1	1.8	102	97
木瓜楚雄	0.317	0.326	1.6	2.3	98	96
木瓜玉溪	0.247	0.385	2.0	1.7	97	102

4 结论
本文建立了液相色谱测定木瓜中的熊果酸和齐墩果酸的方法，在ZORBAX Stable Bound (4.6´10 mm, 1.8m) C₁₈ 快速分离柱上，用甲醇水为流动相，可在10 min 内完全分离木瓜中的熊果酸和齐墩果酸；采用蒸发光散射检测器检测，实现了无紫外吸收物质的高灵敏检测；且在样品前处理中采用了基质固相分散技术，样品前处理步骤非常简单，不需要特殊的仪器设备，成本低。总之，该方法准确可靠，重现性好，回收率满意，检出限较低，可用于木瓜中熊果酸和齐墩果酸含量的准确，具有实用价值。