Kong Weisong 1,2, Tang Dangyu2,3, Zeng Xiaoying 2,3, Zhe Wei 2,3, Shi Honglin 2, Zhang Junsong 1
(1. Key Lab of Tobacco Chemistry of Yunnan Province, Yunnan Acedemy of Tobacco Science, Kunming 650106; 2. Zhengzhou University of light industry, Zhengzhou 550002; 3. Technology Center of Hongyun and Honghe Group, Kunming 650202, China)
Abstract A method for the determination of phenols in mainstream smoke by rapid column high performance liquid chromatography and sample preparation with high-speed homogenization was studied. The phenol was extracted with 1% acetic acid solution by high-speed homogenization, and was separated on a ZORBAX Stable Bound (2.1×50 mm, 1.8mm) rapid column with acetonitrile (containing 1% of acetic acid) and 1% acetic acid gradient elution as mobile phase at a flow-rate of 1.0 mL/min. The phenol can be separated completely with in 5.0 min. This method was applied to the determination of phenols in main stream smoke with satisfactory results.
匀浆法提取-快速液相色谱法测定卷烟主流烟气中苯酚
孔维松 1,2；汤丹俞1,3；曾晓鹰1,3；者 为1,3；施红林 1；张峻松2
(1云南省烟草化学重点实验室，云南烟草科学研究院，昆明 650106；2 郑州轻工业学院，郑州 550002； 3红云红河集团技术中心，昆明：650202)
摘要 研究了用匀浆法提取，快速液相色谱法测定卷烟主流烟气中苯酚的方法，卷烟主流烟气样品用剑桥滤片捕集，以1％的醋酸匀浆法提取滤片上捕集的苯酚；然后采用ZORBAX Stable Bound (2.1´ 50 mm, 1.8 mm) 快速分离柱，乙腈和0.5%的醋酸为流动相分离，用荧光检测器检测，激发波长为272 nm，发射波长为309 nm。方法日内相对标准偏差为2.4％，日间相对标准偏差为3.5%；加标回收率为97.2%-104.5%，结果令人满意。
关键词 苯酚，快速液相色谱，主流烟气，匀浆提取
卷烟烟气中酚类物质含量的多少直接影响着卷烟的抽吸品质，某些酚类物质还可能影响卷烟的口感，引起涩味、辣味和余味不干净等[1,2]。特别是最近我国国家烟草专卖局将以CO、HCN、NNK、NH3、 B[a]P、苯酚和巴豆醛等7种成分作为卷烟安全性评价指标，卷烟主流烟气中苯酚的测定进一步引起了人们的关注。目前苯酚的测定主要有分光光度法、气相色谱法和液相色谱法等 [3-10]。用分光光度法只能近似测定酚的总量，用气相色谱法直接测定时苯酚易拖尾，峰面积重现性差；因此高效液相色谱法成为了测定苯酚最常用的方法，用液相色谱分离检测酚类化合物已有大量文献报道。但大多采用剑桥滤片捕集，1％的醋酸超声浸取，高效液相色谱-荧光检测器测定苯酚的方法[3-10]。超声法虽然是一种新型的提取技术，但就目前而言提取时间长、能耗高，噪声大，环境欠友好。
匀浆提取是指组织通过加入萃取溶剂进行组织匀浆或磨浆，以提取组织中有效成分的一种提取方法，该方法具有提取完全、效率高、能耗低等特点，目前已在样品前处理中得到广泛应用[11-12]。但是在卷烟烟气分析中的应用还未见报道过。我们研究了用剑桥滤片捕集卷烟烟气中的苯酚，匀浆法提取，快速液相色谱测定的方法，取得了满意结果。
1. 实验部分
1.1. 仪器与试剂
HP 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；包括 HP 1100 四元泵，HP 1100 自动进样器，HP 1100柱温箱，HP 1100荧光检测器，Chemical Station 色谱工作站。
RM200型20孔道自动吸烟机 (Borgwaldt，德国)；T10型高速匀浆机 (德国IKA 公司)；乙腈：高效液相色谱专用（美国Fisher公司生产）；冰醋酸：分析纯试剂；无酚蒸馏水：每升蒸馏水中加入1.0 g硫酸铜，用石英亚沸蒸馏器重蒸；苯酚标样（含量≥ 99%；瑞士Fluka公司生产），用乙腈配成1.0 mg/mL的储备液，使用时用乙腈稀释成所需浓度的标准工作液。
1.2. 样品处理
卷烟样品每样取1条，在GB/T 16447规定的条件下进行平衡，挑选平均重量± 0.02 g和平均吸阻± 49 Pa的卷烟，在YC/T 29规定的条件下用吸烟机进行抽吸，每次测定选4支烟抽吸，用44 mm的玻璃纤维剑桥滤片捕集卷烟主流烟气。卷烟抽吸完后把剑桥滤片剪碎，放入100 mL的锥形瓶中，加入50 mL 1％的醋酸溶液，置于高速匀浆机中20000转匀浆萃取1.0 min。取2.0 mL的提取液用0.45 m m的针头过滤器过滤，供液相色谱分析用。
1.3. 色谱条件
色谱柱为ZORBAX Stable Bound (2.1´ 50 mm, 1.8 mm)快速分离柱；流动相为 乙腈(内含1%的醋酸)和1％的醋酸溶液梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；梯度变化为：A乙腈(内含1%的醋酸)，B 1％的醋酸，按：0 min (A 0% + B 100%)，2.0 min (A 40 % + B 60%)，3.0 min (A 0% + B 100%),每样品分析时间为5.0 min。用荧光检测器检测，激发波长为272 nm，发射波长为310 nm。进样体积为5.0 L 在该条件下标样和烟气样品的色谱图见图-1。
2. 结果与讨论
2.1 样品前处理
分别用匀浆法、振荡浸取法和超声波浸取法对相同的样品进行提取比较，结果见表-1，由表-1数据可知，高速匀浆法提取所需时间明显少于其它两种提取方法，所以本实验采用高速匀浆法提取，提取时间为1.0 min与1.5 min回收率差别不大，从提高效率的角度考虑，本实验选择提取时间为0.5 min，匀浆机转速未20000 转/min。
表1 不同处理方法的回收率
|
项目 |
振荡法 |
超声波 |
高速匀浆法 |
||||||
|
提取时间 (min) |
20 |
40 |
60 |
10 |
20 |
30 |
0.5 |
1.0 |
2.0 |
|
峰面积 |
326 |
389 |
368 |
324 |
372 |
389 |
352 |
391 |
374 |
|
回收率 (％) |
85.8 |
102.4 |
96.8 |
85.3 |
97.9 |
102.4 |
92.6 |
102.9 |
98.4 |
2.2 分离条件的选择
用乙腈–水作流动相，苯酚不能获得很好的分离，而且峰有拖尾。这是因为酚羟基易产生电离，在固定相表面有双重的保留机制。改用乙腈醇(内含1%的醋酸)和1％的醋酸溶液作流动相可使酚的电离被抑制，成为中性分子在反相条件下的疏水缔合物，可使分离效果和峰型得到较大改善。实验表明用梯度洗脱，当梯度变化为：A乙腈(内含1%的醋酸)，B 1％的醋酸，按：0 min (A 0% + B 100%)，2.0 min (A 40 % + B 60%)，3.0 min (A 0% + B 100%) 的梯度条件有较好的分离效果且分离时间短，因此实验选用该梯度条件。在该条件下，苯酚在1.83 min 左右出峰，每5.0 min可分析一个样品，和常规方法[10]相比，可节约80％以上的分离时间。
2.3 检测波长的选择
样品中苯酚由其保留时间及荧光检测扫描所得的激发光谱图和发射光谱图对照确认，苯酚的最大激发波长为272 nm, 发射波长309 nm，因此实验选用该激发波长和发射波长。
2.4工作曲线与检测限
分别配制浓度范围在0.2- 50 mg·L-1 范围内的标准溶液，在选定测定条件下进样5.0 mL。根据检测器测得的峰面积A（单位：mAU）对应苯酚的浓度C（单位：mg·mL-1）进行线性回归，得到回归方程。回归方程为：C = 0.029 + 0.0246 A，r = 0.9991。把最小浓度的溶液继续稀释，依次进样5.0 mL，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的浓度以确定检出限，得苯酚的检出限为20 mg·L-1。
2.5 日内精密度实验
卷烟样品在相同条件下平行测定7次 (同批次处理)，并计算7次平行测定结果的相对标准偏差，可得苯酚的RSD为2.4%；说明方法精密度良好。
2.6 日间精密度实验
卷烟样品在不同时间内测定(每天测定1次，共7次)，计算7次测定结果的相对标准偏差，可得苯酚的RSD为3.5%；说明在不同时间内测定，方法精密度仍然良好。
2.7 回收率实验
样品按选定的样品前处理条件处理，并按选定色谱条件进样分析，测定时捕集相同的烟气样品2份，其中一份为基准，另一份加入已知量的苯酚 (设 0.05 mg、0.1 mg、0.2 mg三个添加量)，在相同条件下测定3次，通过加入标准的测出量除以标准加入量计算回收率。得苯酚的回收率在97.2-104.5%之间说明方法回收率很高。
2.8 与其它测定方法的比较
按1.2所述的方法和中国烟草行业标准 [10] 分别对同一品牌不同批次卷烟样品主流烟气中的苯酚进行测定，测定数据列于表-2中。从表中可以看出，对于相同的卷烟样品，按照本文优化的方法检测出的苯酚含量和烟草行业标准相符合。
表2 不同方法测定的苯酚含量（单位：mg·cig-1）
|
使用的方法 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
本方法 |
13.1 |
12.4 |
13.3 |
13.5 |
13.6 |
|
烟草行业标准 |
12.7 |
11.2 |
14.2 |
12.2 |
14.3 |
2.9 卷烟样品测定
按照1.2所述的方法对国内7个不同品牌卷烟主流烟气中的苯酚进行测定，卷烟类型、对应的焦油量和测定结果列于表-3中。从表中可以看出，卷烟主流烟气中苯酚释放量与卷烟的焦油量有关，焦油量高的卷烟一般情况下主流烟气中苯酚释放量也相应的高，低焦油卷烟苯酚含量较低(如7#卷烟)。
表3 卷烟样品主流烟气中苯酚含量的测定结果 (单位：mg·cig-1)
|
烤烟型 |
混合型 |
||||||
|
编号 |
1# |
2# |
3# |
4# |
5# |
6# |
7# |
|
焦油量（mg·cig-1） |
17 |
15 |
15 |
12 |
10 |
8 |
3 |
|
苯酚含量（μg·cig-1） |
17.2 |
15.8 |
14.2 |
12.8 |
11.3 |
8. 79 |
3.78 |
3 结论
研究了用匀浆法提取，高效液相色谱-荧光检测法测定卷烟主流烟气中苯酚(国家烟草专卖局确定的7种有害成分之一)的方法，高速匀浆法提取具有提取完全、效率高、能耗低等特点，所需时间明显少于振荡浸取法和超声波浸取法。本方法还采用安捷仑ZORBAX Stable Bound (2.1´ 50 mm, 1.8 mm) 快速分离色谱柱，可5.0 min分析一个样品；和常规液相色谱分析相比，分析时间缩短80％以上，大大节约了分析时间，节约了流动相消耗，提高了工作效率。