Tang Dangyu1,2, Zeng Xiaoying , Zhe Wei , Yang Guangyu , HuQiufen
(1. Key Lab of Tobacco Chemistry of Yunnan Province, Yunnan Acedemy of Tobacco Science, Kunming 650106; 2. Technology Center of Hongyun and Honghe Group, Kunming 650202)
Abstract A new method for the determination of leaf pigments in tobacco by ultra-performance liquid chromatography was studied. The leaf pigments were extracted from the tobacco sample by high-speed homogenization with acetone. Then they were separated on a Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 (2.1 ´ 50 mm, 1.7 m m) column with acetonitrile and water gradient elution as mobile phase at a flow-rate of 0.6 mL/min. The six leaf pigments were achieved a baseline separation within 3.0 min. The recoveries of leaf pigments were 94~ 105%, and relative standard deviations were 2.2~ 3.2%. This method was applied to the determination of leaf pigments in tobacco with good results.
超高效液相色谱法测定烟草样品中的植物色素
汤丹俞1,2；曾晓鹰；者为；杨光宇；胡秋芬
．云南省烟草化学重点实验室，云南烟草科学研究院，昆明 650106；2.红云红河集团技术中心，昆明650202)
摘要 研究了用超高效液相色谱法测定烟草样品中的植物色素；烟草样品中的植物色素用丙酮匀浆法提取，然后以Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 (2.1 ´ 50 mm, 1.7 m)色谱柱为固定相，乙腈-水梯度洗脱为流动相，检测波长为450 nm。在该条件下，烟草中几种主要的色素在3.0 min内达到完全分离，方法标准回收率为94 105%, RSD为2.2 3.2%，结果令人满意。
关键词 超高效液相色谱法；植物色素；烟草；匀浆法
植物色素是烟草生长和利用太阳能进行光合作用的重要物质；它对烟叶的色泽和香味也有重要影响，烟叶调制过程中色素降解完全和得当，会使烟叶香气增加，色泽上等。因此烟草中植物色素的准确测定对烟草质量评价具有积极的意义 [1,2]。烟草色素的测定常用分光光度法和高效液相色谱法[3 5]，但是光度法准确性较差，传统的液相色谱法分析时间较长。
超高效液相色谱是2004年waters公司推出了的新技术，这项技术突破了传统色谱分析的局限性，将分离度、分析速度和检测灵敏度同时提高到了一个新水平。进几年来超高效液相色谱技术在国内得到了广泛应用，但用于烟草中植物色素的测定还未见报道过[6-8]。我们研究了用丙酮匀浆法提取，超高效液相色谱测定烟草中植物色素的方法，烟草中几种主要的色素在3.0 min内达到完全分离，和常规方法相比，大大节约了分析时间。
1. 实验部分
1.1. 主要仪器和试剂
Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统，包括四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器和Empower色谱工作站。
水为石英亚沸蒸馏水并用Milli-Q50超纯水仪处理，电阻³ 18 m .cm；
乙腈和丙酮均为色谱纯进口试剂（Fisher公司生产）；叶绿素-a、叶绿素-b、叶黄素、-胡萝卜素、新叶黄素和脱镁叶绿素标准（购于Sigma公司和Fluka公司生产，含量>97%）。
1.2. 色谱条件
色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 (2.1 ´ 50 mm, 1.7 m)；流动相为乙腈-水梯度洗脱，以体积比按0 min (乙腈90%＋10％水), 2.0 min (100％乙腈)的梯度条件，流速为 0.6 mL/min，检测波长为 450 nm，该色谱条件下标样和烟草样品的色谱图见图1。
图1 烟草样品(a)和色素标样(b)色谱图
(1) 新叶黄素，(2) 叶黄素，(3) 叶绿素-a，(4)叶绿素-b，(5) 脱镁叶绿素，(6) b -胡萝卜素
1.3. 样品处理
准确称取烟样0.2 g，置于50 mL锥型瓶中，准确加入丙酮20 mL，置于高速匀浆机中20000转/min 匀浆提取2.0 min；滤出提取液；再次加入20 mL丙酮匀浆提取2.0 min并滤出萃取液，合并两次提取液并定容到50 mL。取5.0 mL的溶液用0.25 m针头过滤器过滤，进样2.5 L 分析。
2. 结果与讨论
2.1 样品前处理
匀浆提取是指组织通过加入萃取溶剂进行组织匀浆或磨浆，以提取组织中有效成分的一种提取方法，该方法具有提取完全、效率高、能耗低等特点，目前已在样品前处理中得到广泛应用 [9-10]；因此本文采用匀浆法处理样品。色素类物质在极性有机溶剂中具有较大的溶解度，一般用丙酮为提取溶剂[5]，本实验中也采用丙酮为提取溶剂。实验结果表明，用20 mL的丙酮，高速匀浆机20000 转/min 提取 2.0 min；两次提取可使样品中的色素完全提出；因此本实验选择分两次用高速匀浆法20000 转/min 提取 2.0 min。
2.2 色谱条件的选择
植物色素一般采用甲醇，水-乙腈，水-四氢呋喃等体系，在本实验中，用甲醇作流动相时 -胡萝卜素峰型较差，而水-四氢呋喃体系系统反压高且毒性大，因此实验选用水-乙腈体系。试验了不同比例的水和乙腈作流动相 包括梯度条件；实验结果表明：按0 min (乙腈A＋10％水), 2.0 min (100％乙腈)的梯度条件烟草样品中的色素能达到完全分离且分离时间短，因此实验选用该条件。
由于所测定的色素在450 nm 处均有大的吸收，本实验选择检测波长为450 nm。
2.3 工作曲线
分别配制浓度为50 g/mL，10 g/mL，2.0g/mL，0.4g/mL，0.08g/mL的标准溶液，进样后计算出不同浓度下的峰面积，计算出回归方程。结果见表-1。根据信燥比S/N=3，测得各组分最低检测浓度，结果见表1。
表1回归方程、相关系数及检测限
| 组分 | 回归方程 | 线性范围 (g/mL) | 相关系数 | 检测限 (ng/ml) |
| 叶绿素-a | A = 5.22 × 10 C + 1870 | 0.2-120 | r=0.9998 | 15 |
| 叶绿素-b | A = 4.18 × 10 C + 262 | 0.3-150 | r=0.9996 | 15 |
| 叶黄素 | A = 2.64 × 10 C + 277 | 0.5-80 | r=0.9998 | 20 |
| b -胡萝卜素 | A = 2.47 × 10 C + 158 | 0.4-100 | r=0.9995 | 20 |
| 新叶黄素 | A = 2.56 ×10 C + 232 | 0.3-60 | r=0.9994 | 20 |
| 脱镁叶绿素 | A = 2.71 × 10 C + 208 | 0.3-80 | r=0.9996 | 48 |
2.4 回收率实验及精密度
回收率实验称取相同样品份，其中一份为对照，另一份加入已知量的色素，通过加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算回收率，结果见表-2。精密度实验准确取烟草样品份，在选定的色谱条件下平行测定次，计算次测定结果的相对标准偏差（RSD），结果见表-2所示。
表2 方法精密度及回收率
| 组分 | 加入量 g/mL) |
测出量 g/mL) |
回收率％ | RSD％(n=7) |
| 叶绿素-a | 10.0 | 9.4 | 94 | 2.2 |
| 叶绿素-b | 10.0 | 10.2 | 102 | 2.5 |
| 叶黄素 | 10.0 | 9.6 | 96 | 2.8 |
| b -胡萝卜素 | 10.0 | 98 | 98 | 2.5 |
| 新叶黄素 | 4.0 | 93 | 93 | 3.0 |
| 脱镁叶绿素 | 4.0 | 105 | 105 | 3.2 |
2.5 样品分析结果
按选定的样品前处理条件和色谱条件测定了烟草样品中的色素含量，结果见表3。
表3 样品分析及结果
| 样品 | 含量(mg/g) | ||||||
| 叶绿素-a | 叶绿素-b | 叶黄素 | -胡萝卜素 | 新叶黄素 | 脱镁叶绿素 | ||
| K326 | 未烘烤 | 1.48 | 1.06 | 0.262 | 0.258 | 0.146 | 未检出 |
| 经烘烤 | 0.0142 | 0.0369 | 0.0892 | 0.108 | 0.0514 | 0.0327 | |
| 云-85 | 未烘烤 | 1.18 | 1.04 | 0.208 | 0.172 | 0.132 | 未检出 |
| 经烘烤 | 0.0112 | 0.0237 | 0.0726 | 0.0863 | 0.0415 | 0.0297 |