Hu Qun, He Shunqin, Cao Jinli, Xue Jinjiao, Hu Qiufen
(School of Chemistry and Biotechnology, Yunnan Nationalities University, Kunming 650031)
Abstract An Ultra-performance Liquid Chromatography (UP-HPLC) method for the determination of flavonoid in hibiscus mutabilis was studied. The flavonoid was extracted from the sample with 90% of methanol by high-speed homogenization. Then the extract was purified by solid phase extraction with Sep-Pak-C18 cartridge. The flavonoid was separated on a Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 (2.1 ×50 mm, 1.7 m m) column, with methanol and 0.2% phosphoric acid (50/50) as mobile phase at a flow-rate of 0.5 ml/min, and monitored with the photodiode array detector at 360 nm. The recoveries of the flavonoid are 96%~ 105%, and relative standard deviations are 1.2%~ 2.1%. This method was applied to the determination of flavonoid in hibiscus mutabilis with good results.
超高效液相色谱法测定木芙蓉中黄酮类物质
胡群，何顺琴，曹靖丽，薛景娇，胡秋芬
云南民族大学化学与生物技术学院；昆明650031)
2009年9月12日收稿；云南省中青年学术带头人培养基金(2005PY01-32)和云南民族药资源委部共建重点实验室开放课题资助
摘要 研究了用超高效液相色谱法测定木芙蓉中黄酮类物质。木芙蓉样品中的黄酮用90%甲醇匀浆法提取；提取液用Waters Sep-Pak-C18 固相萃取小柱预分离，以Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 (2.1 ´ 50 mm, 1.7 m)色谱柱为固定相，0.2%的磷酸和甲醇(50/50)为流动相，在该色谱条件下，木芙蓉中主要的黄酮成分在3.0 min内可达到基线分离；用紫外二极管阵列检测器检测。方法标准回收率为96%－105%, 相对标准偏差为1.2%－2.1%。用该方法测定了几种木芙蓉样品中的黄酮类物质，结果满意。
关键词 超高效液相色谱；固相萃取；木芙蓉；黄酮
木芙蓉始载于《本草纲目》，为锦葵科木槿属植物。具有很好的凉血、解毒、消肿、止痛等功效。黄酮类化合物等是木芙蓉的主要活性成分；木芙蓉所含黄酮类化合物包括懈皮素、山奈酚、芦丁、山奈酚-3-芸香糖苷等。由于黄酮具有抗肿瘤、抗突变、预防齲齿等多种药效，因此研究木芙蓉中黄酮类化合物的含量将有助于探索有效成分与疗效间的关系[1-3]。目前黄酮的测定方法主要用光度法、电化学法和色谱法，其中高效液相色谱法是最有效的方法[4-7]。
超高效液相色谱是2004年waters公司推出的新技术，这项技术突破了传统色谱分析的局限性，将分离度、分析速度和检测灵敏度同时提高到了一个新水平。进几年来超高效液相色谱技术在国内得到了广泛应用，但用于木芙蓉中黄酮的测定还未见报道过 [4，8]。我们研究了用匀浆法提取，超高效液相色谱测定木芙蓉中黄酮的方法，样品中几种主要的黄酮在3.0 min内可达到完全分离，和常规方法相比，大大节约了分析时间。
1 试验部分
1.1主要仪器与试剂
Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统，包括四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器和Empower色谱工作站。
甲醇：高效液相色谱专用（Fisher公司生产）；水为石英亚沸蒸馏水并用Milli-Q50 (美国Millipore公司) 超纯水仪处理，电阻³ 18.cm-1；芦丁，山奈酚-3- -芸香糖苷，(3) 山奈酚-3- -刺槐双糖苷，槲皮素和山奈酚标样（分别购于Fluka公司和Sigma公司，含量>95%）。
1.2色谱条件
色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 (2.1 ´ 50 mm, 1.7 m),购于美国Waters公司，固相萃取柱为Waters Sep-Pak-C18固相萃取小柱 (柱腔容积为1.0 mL，萃取容量为30 mg，粒度为30 m)；流动相为：0.2%磷酸甲醇 (50:50，V/V)，流速为0.5 ml/min；检测波长为360 nm，进样体积5.0 l。上述色谱条件下样品和标样在360 nm波长处色谱图见图。
图黄酮标样(b)和木芙蓉样品(a)色谱图
(1) 芦丁，(2) 山奈酚-3-O- -芸香糖苷，(3) 山奈酚-3-O- -刺槐双糖苷， (4) 槲皮素，(5) 山奈酚
1.3 样品处理
木芙蓉样品粉碎后过80目筛，准确称取约2.0 g，加入50 ml 90％甲醇水溶液 置于高速匀浆机中20000转/min 匀浆提取2.0 min；取5.0 mL的提取液通过Sep-Pak-C18固相萃取小柱，弃去前面的2 mL，收集后面的3 mL用0.25针头过滤器过滤，进样5.0 分析。
2 结果与讨论
2.1分离条件的选择
用甲醇水作流动相，几种黄酮成分不能获得很好的分离，而且峰有拖尾；改用甲醇-0.2%磷酸溶液作流动相可使分离效果和峰型得到较大改善，试验了用不同比例的甲醇和磷酸溶液分离黄酮；当磷酸溶液和甲醇的比例为50:50 (V/V) 时可让样品中的主要黄酮达到完全分离且分析时间较短，因此试验选用该流动相。
2.2检测波长的选择
由于各黄酮在360 nm处均有较大吸收，因此实验择检测波长为360 nm。
2.3样品前处理
匀浆提取是指组织通过加入萃取溶剂进行组织匀浆或磨浆，以提取组织中有效成分的一种提取方法，该方法具有提取完全、效率高、能耗低等特点，目前已在样品前处理中得到广泛应用[9-10]；因此本文采用匀浆法处理样品。黄酮类物质在极性有机溶剂中具有较大的溶解度，一般用甲醇为提取溶剂[4-6]，本实验中也采用甲醇为提取溶剂。实验结果表明，每2.0 g的样品用50 mL 90％的甲醇提取，高速匀浆机20000转/min提取2.0 min可使样品中的黄酮完全提出；因此本实验选择分两次用高速匀浆法20000转/min提取2.0 min。
木芙蓉中除含有黄酮类物质外，还含有脂类，蜡质，色素等弱极性物质；该类物质会影响黄酮类物质的检测，并且在本实验的流动相条件下不能完全洗脱下，在18柱上残留积累，使色谱系统的反压增大，并降低柱效，故样品分析前需作脱脂处理。一般文献报道用正己烷，石油醚等非极性有机溶剂进行脱脂，但是用有机溶剂脱脂时间长操作麻烦，还会在一定程度上造成黄酮类物质损失，影响分析结果。因此我们研究了了先用90％甲醇回流提取样品中的黄酮类成分，提取液用18固相萃取小柱脱脂的方法。固相萃取小柱用3 ml甲醇活化，然后用10 ml水洗净小柱上的甲醇，取90％甲醇的样品提取液通过小柱，这样弱极性脂类、蜡质、色素物质保留在小柱上，而黄酮类物质在该流动相条件下在小柱上不保留，这样可简便快速的达到样品预分离的目的，用固相萃取脱过脂的样品可直接进样进行色谱分析。
2.4 回归方程、相关系数及检测限
分别配制浓度为100g/ml，20g/ml，4.0g/ml，0.8g/ml的标准溶液，进样后根据不同浓度的峰面积计算出回归方程，结果见表。根据信燥比S/N=3，测得各组分最低检测浓度，结果见表。
表回归方程、相关系数及检测限
| 组分 | 回归方程 | 线性范围g/ml) | 相关系数 | 检测限(ng/ml) |
| 芦丁 | A=1.57×10 C + 118 | 0.12-150 | r=0.9996 | 12 |
| 山奈酚-3- -芸香糖苷 | A=1.86×10 C – 162 | 0.10-180 | r=0.9998 | 10 |
| 山奈酚-3- -刺槐双糖苷 | A=1.94×10 C + 147 | 0.10-150 | r=0.9996 | |
| 槲皮素 | A=2.63×10 C + 162 | 0.05-120 | r=0.9995 | |
| 山奈酚 | A=2.74×10 C – 186 | 0.05-100 | r=0.9998 |
g/mL， A 峰面积 (Peak area)
2.5精密度实验
准确取相同的木芙蓉样品份，按上述样品前处理方法处理，在选定色谱条件下重复测定次，得芦丁峰面积的RSD为1.2%，山奈酚-3- -芸香糖苷峰面积的RSD为1.4%，山奈酚-3- -刺槐双糖苷峰面积的RSD为1.6%，槲皮素峰面积的RSD为1.8%，山奈酚峰面积的RSD为2.1%，说明方法精密度良好。
2.6 回收率实验
样品按前述样品前处理的方法处理后按选定色谱条件进样分析，测定时每样准确称取相同样品两份，其中一份为基准，另一份加入已知量的黄酮标样，通过加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算回收率。得芦丁的回收率为96 102%，山奈酚-3–芸香糖苷的回收率为97 104%，山奈酚-3- -刺槐双糖苷回收率为97 101%，槲皮素峰面积的回收率为98 105%，山奈酚的回收率为96 103%，说明方法回收率很高。
2.5样品分析结果
用该方法测定了不同木芙蓉样品中的芦丁、山奈酚-3- -芸香糖苷、山奈酚-3- -刺槐双糖苷、槲皮素和山奈酚，样品按前述样品前处理的方法处理后按选定色谱条件进样分析，结果见表。
表样品分析及结果
| 组分 | 样品（mg/g） | ||||
| 木芙蓉叶大理 | 木芙蓉根大理 | 木芙蓉茎大理 | 木芙蓉叶楚雄 | 木芙蓉叶红河 | |
| 芦丁 | 17.1 | 8.94 | 11.0 | 20.5 | 17.5 |
| 山奈酚-3- -芸香糖苷 | 22.2 | 5.74 | 8.87 | 22.9 | 16.3 |
| 山奈酚-3- -刺槐双糖苷 | 17.3 | 7.22 | 9.72 | 16.3 | 15.2 |
| 槲皮素 | 10.1 | 5.08 | 6.89 | 10.9 | 8.96 |
| 山奈酚 | 6.59 | 4.39 | 5.84 | 7.2 | 6.85 |
3 结论
本方法超高效液相色谱法，用0.2%的磷酸溶液甲醇 (50:50，V/V)为流动相，可在3.0 min 内完全分离木芙蓉中的种主要黄酮类物质，是目前能同时测定木芙蓉中黄酮种类最多地分析体系之一；而且和常规液相色谱相比，大大缩短了分析时间。本方法还采用90％甲醇回流提取木芙蓉的黄酮类物质，用固相萃取预分离脱脂，克服了用有机溶剂脱脂时间长、操作麻烦，会造成黄酮类物质损失的缺点，而且固相萃取可实现操作自动化，使样品前处理操作更为简便快速。该方法的建立在一定程度上为木芙蓉中的黄酮类物质研究提供了方法。