Xue Jingjiao, Duan Yuanxing, Cao Jingli, He Shunqin, Hu Qiufen
(School of Chemistry and Biotechnology, Yunnan Nationalities University, Kunming 650031)
AbstractA high performance liquid chromatography method for the determination of ferulic acid in angelica sinensis(Oliv.)diels was studied. The ferulic acid was extracted from samples by high-speed homogenization with 80% methanol solution. The extract was separated on a waters Xterra RP18 column (3.9×150 mm,5 μm) using 10% acetonitrile (containing 0.1% acetic acid) as mobile phase at flow rate 1.5 mL/min. The detection wavelength was 270 nm. Under this condition, the linear of ferulic acid was obeyed in the range of 1.0～100 μg/mL. The recoveries of the ferulic acid were 96-102%, and relative standard deviation was 1.8%. The method was extraction and determination of ferulic acid in angelica sinensis(Oliv. ) diels. with good results.
Keywords angelica sinensis(Oliv.) diels; ferulic acid; high-speed homogenization; HPLC
高效液相色谱法测定当归中的阿魏酸的研究
薛景娇，段沅杏，曹靖丽，和顺琴，胡秋芬
（云南民族大学化学与生物技术学院，云南650106）
摘要 研究了用高效液相色谱法测定当归中的阿魏酸，单归样品用80%的甲醇匀浆法提取，提取液中的阿魏酸以Waters Xterra RP18（3.9×150 mm，5μm）色谱柱为固定相，10%乙腈（含0.1%醋酸）为流动相分离，流速为1.5 ml/min，检测波长270 nm。在该色谱条件下，阿魏酸浓度在1.0 ～100 μg/mL 内成良好的线性关系，标准回收率在96-102%之间，相对标准偏差(RSD)为1.8%，结果令人满意。
关键词 当归；阿魏酸；匀浆法提取；高效液相色谱法
1 引言
当归 Angelica sinensis(Oliv.)Diels 是伞形科当归属一种多年生草本植物。干燥的贮藏根入药，是一种常用中药材，有撌骄殴閿之称。其性温，味甘辛，具有补血活血、调经止痛、润肠通便之功效。可用于治疗血虚诸证，眩晕心悸、月经不调、经闭、痛经、崩漏、虚寒腹痛、肠燥便秘、风寒湿痹、跌打损伤等症[1-2]。阿魏酸是当归中的重要药效成分。现代研究表明，阿魏酸具有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌、抗病毒、抗病变和防癌等作用[3]。
目前，有关当归药材中阿魏酸的前处理提取方法报道有超声法[4-6]、加热热回流法[7-9]等，其含量测定方法的研究报道很多，主要有薄层洗脱比色法、薄层显色扫描法、直接扫描法及高效液相色谱法[10-13]。匀浆提取是指组织通过加入萃取溶剂进行组织匀浆或磨浆，以提取组织中有效成分的一种提取方法，该方法具有提取完全、效率高、能耗低等特点，目前已在样品前处理中得到广泛应用[14-15]。但是用于单归中的阿魏撒分析还未见报道过，我们研究了用匀浆法提取，高效液相色谱法(HPLC)测定当归中阿魏酸的方法，取得满意结果。
2 实验部分
2.1主要仪器与试剂
Agilent1100高效液相色谱仪(包括二元泵，自动进样器，二极管阵列检测器，柱温箱，Chemstation 色谱工作站)；Waters XTerra RP18 (3.9×150 mm ，5μm)色谱柱。阿魏酸对照品(购于瑞士Fluka公司)，使用时用甲醇配成1.0 mg/mL的标准储备液，所需标准工作液由该储备液稀释得到，甲醇和醋酸为分析纯、乙腈为色谱纯，所用水为高纯水。
2.2色谱条件
色谱柱为 Waters XTerra RP18(3.9×150mm ，5μm)，流动相为10%乙腈(含0.1%醋酸)，流速为1.5mL/min，检测波长270 nm，进样体积10.0μL，在该条件下，标样和实际样品的色谱图见图1。
图1 阿魏酸标样(a)和当归样品(b)色谱图
2.3样品前处理
当归样品粉碎后过80目筛，准确称取约0.5g，加入50ml 80%甲醇水溶液, 置于高速匀浆机中20000转/min 匀浆提取2.0min；取5.0mL的提取液用0.25μm针头过滤器过滤，进样10.0μL分析。
3 结果与讨论
3.1色谱条件的选择
阿魏酸在中性条件下易电离，用反相色谱分离峰形较差，故需采用调节流动相pH值抑制电离的方法，使其变为分子态的酸在柱子上保留而得到分离。实验表明，在流动相中含0.1%的醋酸可使阿魏酸的电离得到充分抑制，在色谱柱上有好的保留且峰形较好，因此本实验选择10%的乙腈(内含 0.1%的醋酸)为流动相。阿魏酸在270nm 处有最大吸收，因此实验选择检测波长为270nm。
3.2样品的制备
阿魏酸在水-甲醇溶液中有较大溶解度[16-18]，液相色谱测定阿魏酸时一般采用水-甲醇为提取溶剂，因此本实验中采用80%的水-甲醇提取。分别用匀浆法、回流提取法和超声波浸取法对相同的样品进行提取比较，结果表明：对于0.5g的样品，用80%的水-甲醇溶液50mL提取；把样品中的阿魏酸完全提出，加热回流提取需要20min 以上，超声浸取30min以上、而高速匀浆机20000转/min提取只需2.0min；高速匀浆法效率明显高于加热回流提取、振荡浸取和超声浸取法；因此本实验选用高速匀浆法20000转/min 提取2.0min。
3.3工作曲线
分别配制100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL的阿魏酸标样，进样10μL，测定不同浓度标准溶液峰面积积分值，以阿魏酸的浓度(C，μg/mL)对峰面积(A)进行回归，结果表明，阿魏酸在1.0μg～100μg/mL和峰面积成良好的线性关系，回归方程为：A = 0.0386 +3.09 C，( r=0.9998)。将小浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样计算，当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的浓度以确定检出限，检测限为20ng/mL。
3.4精密度试验
在上述色谱条件下，取当归样品连续测定6次，计算6次结果的相对标准偏差，方法的RSD为1.8％，结果表明精密度良好。
3.5加样回收率试验
回收率实验取相同样品4份，其中一份为对照，另外3份分别加入0.5、1.0、2.0mg的阿魏酸标样，按选定样品前处理条件处理并按选定色谱条件测定，通过加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算回收率，方法标准回收率在96-102%之间。
4 结论
本方法采用匀浆法提取，高效液相色谱法测定当归中的阿魏酸。高速匀浆法具有提取完全、效率高、能耗低等特点，所需时间明显少于回流提取和超声波浸取法；此外本方法提取后就可直接进样分析，样品前处理步骤非常简单，样品前处理过程中目标物的损失也减少，方法回收率和精密度均很高。总之，重现性好，回收率满意，检出限较低，可用于当归中阿魏酸含量的分析，具有实用价值。