Lv Yun-Kai, Song Yan-Ling, Yan Shuai-Lei
(College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Key Laboratory of Analytical Science and Technology of Hebei Province, Baoding 071002, China)
Abstract In this paper, a molecularly imprinted polymers (MIP) for sarafloxacin was prepared by the use of itaconic acid as the functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate as the crosslinking monomer. To improve selectivity, cobalt(II) ions was used to form metal-template complex, which provided the specific binding sites similar to metal-chelate antibody. The influences of different anions and cations on the recognition performance of the MIP were investigated in protic solvent. Due to the specific structure of the complex of cobalt(II)-sarafloxacin, it increased the specific selectivity of the polymer to sarafloxacin. In addition, we founded that anions also promoted the molecular recognition, leading to a further increased the specific selectivity of the polymer. Scatchard analysis show that two classes of binding sites existed in the metal complex imprinted polymers, with their maximum apparent binding capacity was estimated to be 51.3 mmol g-1 and 32.6 mmol g-1, respectively. Over the traditional organic phase synthesis of MIP, the present protocol was achieved in aqueous media, keeping the consistent of the preparation process and recognition process of the MIP. The results on substrate selectivity of imprinted polymer revealed that the prepared MIP had better binding affinity for template than the other tested compounds.
阳阴离子对沙拉沙星-Co(II)配位印迹聚合物水相识别性能的影响
吕运开，宋艳岭，闫帅磊
（河北大学化学与环境科学学院，河北省分析科学技术重点实验室，河北 保定 071002）
摘要 以兽药沙拉沙星为模板，以衣康酸(ITA)为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂，制备了分子印迹聚合物。为了提高印迹聚合物的选择性，钴离子用作形成金属-模板络合物，能产生类似于金属螯合抗体的专一性结合位点。在质子溶剂中，研究了不同阴离子和阳离子对沙拉沙星的吸附性能的影响。由于Co2+与沙拉沙星所形成配合物具有特异的几何构型，从而增加了聚合物对模板分子的特异选择性，研究中发现阴离子也参与了识别过程，提高了聚合物对沙拉沙星的特异选择性。Scatchard分析研究发现存在两种结合位点，最大吸附量分别为51.3 mmol g-1和32.6 mmol g-1。与常规合成的分子印迹聚合物相比，本研究实现了水相介质合成和识别，选择性吸附实验结果表明，该聚合物对沙拉沙星具有较高的选择性结合能力。
关键词 分子印迹聚合物；沙拉沙星；静态吸附；络合物
喹诺酮类药物是近20年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗菌素,被大量用于治疗、预防和促生长[1] 。它在动物性食品中的残留日益突出，人们长期食用含有药物残留的动物性食品会对人类的健康构成潜在的威胁。为了控制喹诺酮类药物在动物性食品中的残留，有必要发展一种测定喹诺酮类药物的快速、灵敏、高选择性的检测方法。其中最重要研究方向是发展性能良好、选择性高的分离介质材料，用于样品前处理与色谱固定相，而合成这种材料的主要方法是分子印迹技术。
分子印迹技术(MIT)是模拟自然界所存在的分子识别作用，如酶与底物、抗体与抗原等,以目标分子为模板合成具有特殊分子识别功能的印迹高分子聚合物(Molecularly Imprinted Polymer, MIP)的一种技术[2]，因为MIP具有预定性、识别性和实用性等特点而在许多领域如色谱中对映体和异构体的分离[3]、固相萃取[4]、化学仿生传感器[5]、模拟酶催化[6]、临床药物分析[7]和膜分离技术[8]等展现了良好的应用前景。
目前多数分子印迹聚合物的制备和应用都局限在有机溶剂中进行，而天然的识别系统以及MIP所面临的实际应用环境则多是水性体系，随着MIP的研究重点从亲脂性有机小分子转移到亲水性化合物，在水相中合成分子印迹日益引起人民的关注。
分子印迹聚合物(MIP) [9]在分子印迹过程中产生的识别位点常常通过离子、氢键和金属配位等作用力选择性地结合印迹分子。目前，在分子印迹中有关氢键和离子作用的研究较多，而金属配位的研究较少。其中氢键是最普遍应用与分子印迹的相互作用中，然而模板与功能单体的相互作用的氢键在水相中很容易被破坏，因为水溶剂与模板分子竞争功能单体，于是基于氢键作用的分子印迹聚合物在高极性的水相或有机相中失去了高识别能力，人们在研究生物识别过程中的相互作用力时发现生物或药物分子和金属离子的结合具有高度专一性及温和的结合和断裂条件，这一点在生物识别体系中有着重要的作用[10]，如血红素、叶绿素、维生素B12分别是铁、镁、钴的配合物。许多药物以金属配合物的形式在人体中起生理作用，如[Ca(EDTA)]2-可用于治疗职业性铅中毒，顺式-二氯二氨合铂(II)具有良好的抗癌活性；2,2-联吡啶须通过金属离子起特定的药理作用[11]。因此，研究金属配位在分子识别中的作用，有助于加深对分子印迹和生物识别过程及机理的理解。由于金属配位键有着它自己独特的优势-作用力强、能在强的极性溶剂中应用，于是金属离子配位MIP的分子识别特性逐渐引起人们的关注。Fujii等[12]首次制得了金属配位分子印迹聚合物，通过Co2+离子把氨基酸结合到席夫碱配基上，在光学拆分N-苄基-D,L-缬氨酸获得了非常高的选择性。因此，对金属配位MIP的识别选择性研究引起了人们的关注。因此，我们以沙拉沙星和金属元素(Co)形成的配合物为模板在水相中合成金属配位MIP，并着重研究了在阴、阳离子对MIP的亲和性和结合量的影响。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
仪器：分析天平，磁力搅拌器(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)，恒温箱，真空泵(保定高新区阳光科教仪器厂)，分样筛，恒温振荡器(太仓市科教器材厂)，离心机(北京医用离心机厂)，微孔过滤器，T6紫外分光光度计(北京普析通用有限公司)，超声波清洗器(保定超声波清洗器厂)。
试剂：沙拉沙星(台州外高桥联通药业有限公司)，乙酸钴(北京市化学试剂厂)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，Sigma-Aldrich Chemie)，衣康酸(北京化学试剂公司)，丙烯酰胺(MA，天津市永大化学试剂开发中心)，甲基丙烯酸(MAA，Sigma-Aldrich Chemie)，偶氮二异丁腈(AIBN，北京化学试剂公司)，甲醇(天津市瑞金特化学品有限公司)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA，天津市纵横工贸有限公司化工试剂分公司)，冰醋酸(北京北化精细化学品有限责任公司)，乙醇(天津市美琳工贸有限公司)。实验所用试剂均为分析纯，实验用水为去离子水或高纯水。
1.2 分子印迹聚合物（MIP）和非印迹聚合物（NIP）的制备
称取沙拉沙星(84.368mg，0.2 mmol)，乙酸钴(49.818 mg，0.2 mmol)溶于6 ml甲醇/水(V/V，5:1)中，超声溶解后放置2 h，使之充分络合，加入0.8 mmol 功能单体(衣康酸，丙烯酰胺，甲基丙烯酸，表1)，1ml EDMA，和6.6 mg的AIBN超声溶解后转入小试管中，在25℃通氩气15 min，然后真空下密封，放入60℃水浴中24 h完成聚合反应，制得棒状疏松聚合物，转入60℃真空箱中干燥，用研钵磨碎，过筛，制得33.5-75 mm的粒状聚合物(MIP)。用4:1乙醇/乙酸作洗脱剂蒸馏萃取，用以洗脱沙拉沙星，直至用T6紫外分光光度计在l=282.4 nm检测不到沙拉沙星为止。然后再用0.1 molL-1 EDTA溶液洗脱2h，以除去残留在聚合物中的Co(II)，最后用甲醇洗脱干净，转入60℃真空箱中干燥备用。
制备丙烯酸和丙烯酰胺聚合物，除更换功能单体外，其余操作步骤同MIP。制备非印迹聚合物（NIP）除不加金属配位模板(乙酸钴(II)和SAR)外，其余操作步骤同MIP。
1.3 聚合物对沙拉沙星的平衡结合实验
准确称取50 mg的印迹聚合物和对比聚合物分别放入25 ml的磨口锥形瓶中，加入5 ml的沙拉沙星和乙酸钴甲醇-水溶液(2 mmol ml-1)，放入恒温水浴振荡器中，在25℃下振荡10 h，然后取吸附液样品于离心试管中，离心后取离心液0.1 ml，用水稀释为10.0 ml，用分光光度计于278.0 nm进行光度分析，测定吸附液中的平衡浓度，根据结合前后溶液中SAR的浓度变化可计算聚合物的结合量。
根据公式(1)，求得不同功能单体聚合物的印迹因子IF。IF = KMIP / KNIP = (QMIP / CfreeMIP) / (QNIP / CfreeNIP) 其中K是不同聚合物的分配系数，Cfree是吸附平衡浓度，Q是不同聚合物吸附量。
2 结果与讨论
2.1 沙拉沙星-Co(II)配位印迹聚合物的合成
2.1.1 功能单体的选择
表1 功能单体的选择
Table 1 Selection of the functional monomers
| 聚合物 | 模板分子 | 功能单体 | 吸附容量Q(SAR) (mmol g-1) |
印迹因子IF |
| MIP | SAR+Co | ITA | 24.2 | 2.87 |
| NIP | ITA | 9.15 | ||
| MIP1 | SAR+Co | MAA | 54.53 | 1.54 |
| NIP1 | MAA | 39.05 | ||
| MIP2 | SAR+Co | AM | 18.42 | 1.36 |
| NIP2 | AM | 15.55 |
以甲基丙烯酸，衣康酸，丙烯酰胺为功能基单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，制备SAR-Co络合物的分子印迹聚合物，通过紫外分光光度计的静态吸附实验，如表1所示，在相同量的三种功能单体中，以衣康酸为功能单体的聚合物的印迹因子最大，因此我们选择以衣康酸为功能单体。
2.1.2 预聚合溶液的紫外特性及合成机理
图1 沙拉沙星甲醇水溶液的吸光度随衣康酸的变化曲线
Fig.1 The curve of titrating ITA to Co(II)-SAR under the monitoring of UV spectrum
[Co(II)]=[SAR]=0.02 μmol·ml-1，[ITA]=0, 0.010, 0.015, 0.020, 0.025 mmol·ml-1
聚合物识别机理的研究对了解印迹和识别的现象非常重要，由于分子印迹技术的原理是基于预聚合溶液中形成的主客体结构，因此对预聚合溶液中模板分子和功能单体的相互作用进行表征是非常重要的。因此，配制一系列Co(II)-SAR浓度一定，而衣康酸的浓度不同的甲醇水溶液。这些溶液的紫外吸光度变化如图1，在286 nm吸收带附近有红移现象，这是由于形成ITA-Co(II)-SAR络合物而使电子云密度降低引起的。当[Co(II)-SAR]: [ITA]=1:1时，溶液最大吸收波长不再变化。由此可推得分子印迹聚合物的合成示意图2
图2 衣康酸分子印迹机理图
Fig. 2 Schematic representation of imprint formation
2.2 MIP吸附特性的影响因素研究
2.2.1 Co2+离子浓度对识别能力的影响
为了考察MIP的识别能力，测定了两种对比聚合物和MIP对SAR的平衡结合量受乙酸钴(II)浓度影响的变化曲线，由图3可看出，MIP的平衡结合量明显大于NIP，表明乙酸钴(II)存在下能够显著地提高MIP选择性识别能力，当乙酸钴浓度达到2 μmol ml-1时MIP的识别能力最强。然后MIP的平衡结合量随乙酸钴浓度的增加而降低。其原因是MIP内Co(II)的结合位点已被Co(II)饱和，溶液中的Co(II)对SAR产生竞争结合，结果MIP的结合量减少。
图3 Co2+浓度对聚合物结合量的影响
Fig. 3 Effect of Co2+ concentration on binding capacity of polymers
图4 pH值对其印迹识别的影响
Fig. 4 Effect of pH on binding capacity of polymers
2.2.2 pH值对MIP识别能力的影响的影响
由于分子印迹聚合物和目标分析物之间是通过金属键相互作用的，因此考察了溶液的pH值对聚合物结合量的影响。如图4，因为当[Co(II)]=2 μmol ml-1，pH=8时Co(II)就开始水解，所以我们在pH=2-7范围内进行考察。由图可知，MIP和NIP对沙拉沙星的结合量随pH值的升高有增加的趋势，这是因为在低pH值时，结合位点被质子化，减小了Co2+与结合位点的作用力，随着pH值的升高，有利于Co2+-SAR络合物的生成，并易与结合位点作用，当pH值为7时达到最大结合量。NIP对沙拉沙星的结合量由于非选择性特异吸附而随pH值的升高有起伏。
2.2.3 阳离子对MIP结合量的影响
用醋酸锌，醋酸铜代替乙酸钴，这些离子具有类似的离子半径，rZn(II)=0.074 nm，rCo(II)=0.072 nm，rCu(II)=0.071 nm，表2表明乙酸钴()介质中MIP的选择性显然大于其余两种介质。这些离子的半径相近，Co(II)与其余两种离子比较，更容易和衣康酸、SAR形成四面体配合物，以致于Co(II)能显著地增加MIP的选择性识别能力。这说明决定MIP的选择性结合作用不是结合位点中金属离子半径，而是所形成配合物的几何构型。
表2 阳离子对MIP结合量的影响
Table 2 Effect of cations on binding capacity of polymers
| 阳离子 | Q(mmol·g-1) |
| Co(II) | 24.36 |
| Cu(II) | 20.85 |
| Zn(II) | 18.20 |
[SAR]=2 mmol·ml-1，[Co(II)]=[Cu(II)]=[Zn(II)]=2 mmol·ml-1
2.2.4 阴离子对MIP结合量的影响
选用氯化钴(II)和硫酸钴(II)代替乙酸钴(II)考察了阴离子对MIP配位识别能力的影响。当Cl–、SO4-2和Ac–的浓度分别为2μmol ml-1时，MIP对SAR的结合量如表3，这些说明阴离子也参与了结合过程，形成多元配合物，造成结构和性质的不同，Ac–能使MIP产生有效的选择性识别能力。而Cl–对MIP结合量的影响明显没有SO4-2对其的影响大，可能是因为两者所带电荷不同，导致阴阳离子结合程度不同所造成的。
图5 MIP的Scatchard曲线
Fig.5 Scatchard plots of MIP
表子3 阴离对MIP结合量的影响
Table 3 Effect of anions on binding capacity of polymers
| 阴离子 | Ac– | Cl– | SO4-2 |
| Q(μmol·g-1) | 25.33 | 23.58 | 18.94 |
[SAR]=2 mmol·ml-1，[Ac–]=[Cl–]=[SO4-2]= 2 mmol·ml-1
2.3 MIP的Scatchard分析
在分子印迹中,常用Scatchard模型评价分子印迹聚合物的结合特性,式(2)为Scatchard方程:Q/c=(Qmax-Q)/Kd (2)式中：Kd代表结合位点的平衡离解常数，Q为结合量，Qmax代表结合位点的表观最大结合量，c表示底物的平衡浓度，以Q/c对Q作图,可求得结合位点的结合参数Kd和Qmax。由图5可见,Q/c对Q不是直线关系，表明MIP对[Co(II)-SAR]2+的结合作用是不均匀的, 具有明显的多抗性。但在图的两端有明显的线性关系，这证明在所研究的沙拉沙星的浓度范围内，MIP存在两类不同的结合位点。通过对图中的直线部分进行拟合,由线性方程的斜率和截距可以求得,聚合物高亲和力结合位点的Kd1=0.29 mmol ml-1, Qmax1=32.61mmol g-1,低亲和力结合位点的Kd2=0.76 mmol ml-1, Qmax2=51.34 μmol g-1.
2.4 印迹聚合物对底物的选择性
选用沙拉沙星、环丙沙星作为底物进行选择性吸附实验，用平衡结合方法测定MIP的结合量，研究了MIP的结合选择性，测定结果见表4。从表4可以看出，MIP对SAR的吸附容量明显大于CIP，说明聚合物对SAR具有很好的识别能力。从分子结构上分析，CIP是在N1上由环丙基取代了SAR的氟苯基，此取代基较小，但是CIP分子的3D优势构象表明，其环丙基和主环平面是垂直的，而SAR的氟苯基则与主环平面几乎平行，使CIP位阻太大，难以进入PM的结合位点，从而使聚合物对它的吸附率降低。
表4 聚合物对沙拉沙星及其结构类似物的选择性吸附
Table 4 selective adsorption of SAR and its analogues by MIP
| 底物 | 平衡浓度/ mmol ml-1 | Q/ mmol g-1 | Kd/ ml g-1 | k |
| SAR | 1.76 | 24.20 | 13.75 | 1.52 |
| CIP | 1.83 | 16.51 | 9.02 |
Kd，分配系数，Kd=Q/Cfree，其中Q表示吸附容量，Cfree表示平衡浓度k，选择性系数，k= Kd(SAR)/Kd(CIP) 其中Kd(SAR)表示沙拉沙星的分配系数，Kd(CIP)表示环丙沙星的分配系数
3 结论
本文通过钴离子与沙拉沙星的配位作用在水相中制备了沙拉沙星的分子印迹聚合物，经实验研究，MIP对沙拉沙星有着较好的吸附效果。金属配位模板聚合物对配基的选择性识别可由金属离子调节。这一特征可满足生物传感器和人造酶体系控制识别能力的要求由于识别作用力是金属配位作用力，因此金属配位模板聚合物可以用于那些氢键易被破坏或干扰的体系，在水相中的分子识别。
ACKNOWLEDGMENT
This work was supported by National Science Foundation of China (No. 20675024), Natural Science Foundation of Hebei Educational Committee (No. 2006407)